DPP-4基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后的相關(guān)性分析

晏 昆，蒙 凌，陳玉芳

(廣州新海醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510300)

大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死是一種重要的缺血性卒中類(lèi)型，也是中國(guó)死亡和殘疾的重要原因[1，2]。動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗塞的主要病理基礎(chǔ)[3]。炎癥反應(yīng)可能在動(dòng)脈粥樣硬化和腦血管疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。編碼二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase，DPP-4)的DPP4基因，也稱(chēng)為細(xì)胞表面抗原CD26，位于染色體2q24.3上，其主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，循環(huán)血小板，單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和某些T細(xì)胞亞群的表面，DPP-4是一種II型跨膜蛋白，通過(guò)脫落過(guò)程被切割下來(lái)并作為可溶形式(sDPP-4)釋放到循環(huán)中，具有作為結(jié)合和信號(hào)蛋白的非酶功能，在炎癥和心血管調(diào)節(jié)中起作用[5～8]。DPP-4已被證明在炎癥反應(yīng)中起雙重作用(促炎癥或抗炎癥)。它可以通過(guò)整合素的上調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞粘附，在白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移，抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)血小板功能中起重要作用。另一方面，它可以發(fā)揮作用通過(guò)增加白細(xì)胞活化閾值，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和維持血管屏障的完整性來(lái)實(shí)現(xiàn)抗炎作用[9～11]。DPP-4基因多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與許多自身免疫性疾病和炎癥性疾病有關(guān)[12]。研究表明，DPP-4基因多態(tài)性與巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、Behcet有一定程度的相關(guān)性[13]。本研究探討DPP-4基因rs1558965、rs1558957位點(diǎn)SNP對(duì)大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后的影響，為大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015年1月至2017年6月我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者110例，均經(jīng)臨床神經(jīng)系統(tǒng)檢查，經(jīng)顱多普勒定義大血管病變，經(jīng)超聲檢查(TCD)、頸動(dòng)脈彩色超聲檢查和頭部磁共振血管造影(MRA)、腦CT和/或MRI確診。大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)為中國(guó)第四次全國(guó)腦血管病大會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)：①顱內(nèi)外：除穿支動(dòng)脈疾病區(qū)獨(dú)立梗死灶外梗死，在顱內(nèi)、顱外大動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)易損板塊狹窄面積≥50%；支動(dòng)脈疾病區(qū)孤立梗死灶類(lèi)型，影像學(xué)檢查穿載體動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化狹窄；非心源性腦梗死；排除其他因素的病因。②主動(dòng)脈弓：多發(fā)性腦梗死病灶，且受累最嚴(yán)重部位為雙側(cè)前循環(huán)及(或)雙側(cè)后循環(huán)部分存在前后一起發(fā)；未檢測(cè)為急性多發(fā)性腦梗死(血小板缺少、血管炎、腫瘤性栓塞等)；未檢測(cè)出心源性腦梗死潛在病因；未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)顱內(nèi)、外LAA病變，易損斑塊狹窄面積≥50%；存在主動(dòng)脈或腫瘤性栓塞潛在病因，影像學(xué)檢測(cè)主動(dòng)脈弓斑塊>4 mm，存在血栓。排除標(biāo)準(zhǔn)：心源性因素引起的腦梗塞、關(guān)節(jié)炎、血液病、腫瘤或腦血管畸形、腦梗塞后出血、嚴(yán)重的肝腎疾病；彌散性血管內(nèi)凝血、自身免疫性疾病、懷孕。所有受試者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 DPP-4基因多態(tài)性多態(tài)性檢測(cè)DPP-4基因報(bào)道SNP位點(diǎn)中本研究選取已證實(shí)的性血管疾病相關(guān)2個(gè)突變位點(diǎn)，分別為rs1558965、rs1558957[14]，具體基因提取方案：肱靜脈抽血4 ml，EDTA-K2抗凝，5000 RPM離心5 min后，去血清加入300 μl人紅細(xì)胞裂解液，混勻震蕩3 min，10000RPM離心30 s。為了消除任何懸浮的蛋白質(zhì)和RNA，使用QIAamp(Qiagen Inc.，Valencia CA)進(jìn)一步純化所有DNA樣品。簡(jiǎn)而言之，將400 μl保存的裂解物置于含有20 μl蛋白酶K的2 ml微量離心管中。然后將管在56 ℃溫育10 min，然后加入400 μl乙醇(96%～100%)。)到樣品。將來(lái)自前一步驟的700 μl混合物應(yīng)用于QIAamp Spin Column并以6000×g(8000rpm)離心1 min。將QIAamp旋轉(zhuǎn)柱置于干凈的2 ml收集管中，并將濾液安全地丟棄。在重復(fù)離心步驟后，將500 μl AW1緩沖液加入到旋轉(zhuǎn)柱中，并以6000×g(8000 rpm)離心1 min。用AW2緩沖液重復(fù)該步驟。在最后一步中，將QIAamp Spin Column置于干凈的1.5 ml微量離心管中，向其中加入150 μl AE緩沖液，然后在室溫下孵育1分鐘，然后以6000×g(8000 rpm)離心1 min。將純化的DNA保存在-20 ℃。通過(guò)設(shè)計(jì)來(lái)自多態(tài)性位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)域的引物并通過(guò)瓊脂糖凝膠上的大小區(qū)分正常和突變等位基因來(lái)選擇DPP-4多態(tài)性。設(shè)計(jì)DPP-4的引物，并由Invitrogen(中華人民共和國(guó)上海)合成。引物序列如下：5’-TGTGAATCCTTTTCCTGCTTTTC-3’(上游引物)；和5’-GCTTGCTATGGAGACCCTGAC-3’(下游引物)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)如下進(jìn)行，PCR以33 μl的總體積進(jìn)行(20～60 ng基因組DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，10 pmol每種引物，10 mmol每種dNTP和50 mmol MgCl2。進(jìn)行反應(yīng)在96孔GeneAmp?PCRSystem 9700(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA USA)。反應(yīng)條件：在94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，包括在94 ℃變性20 s，在55 ℃退火35 s，然后在72 ℃延伸35 s；最后在72 ℃延伸10 min。將8微升所得PCR產(chǎn)物用于用限制酶過(guò)夜消化，并使用4%瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(BMA，Rockland，ME，USA)分析以確定DPP-4等位基因。G→A的變體可導(dǎo)致Nhe I限制性位點(diǎn)的出現(xiàn)，G→C的變體可導(dǎo)致Nhe Ⅱ限制性位點(diǎn)的出現(xiàn)。通過(guò)限制性?xún)?nèi)切核酸酶Nhe I(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過(guò)在含有0.5×Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液(115 V，30～40 min)的2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。電泳后，使用基于紫外線(xiàn)的凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察和拍攝這些條帶。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)觀(guān)察DPP-4基因rs1558965(AG+GG、AA)、rs1558957(GG、GC+CC)基因型一般資料，統(tǒng)計(jì)其預(yù)后情況，并分析不同基因型與預(yù)后間相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，生存期比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spesrman相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型基本臨床資料的比較由表1可見(jiàn)，DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)AA基因型高血壓比例、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平高于AG+GG基因型 (P< 0.05)；而在男性、糖尿病、吸煙史、飲酒史比例分布以及年齡水平比較上，AA基因型和AG+GG基因型相近 (P> 0.05)。

表1 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型基本臨床資料的比較

a與AG+GG組比較，P< 0.05

2.2 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析由表2及圖1可見(jiàn)，DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)AG+GG組3年生存率及生存期均低于AA組(χ2=17.89，Z=15.642，P< 0.05)。

表2 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析

圖1 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析

2.3 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型與預(yù)后相關(guān)性分析由表3可見(jiàn)，DPP4 rs1558965 AA基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后有相關(guān)性(P< 0.05)，DPP4 rs1558965 AG+GG基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性(P> 0.05)。

表3 DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)不同基因型與預(yù)后相關(guān)性分析

2.4 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型基本臨床資料的比較由表4可見(jiàn)，在男性、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒史比例分布以及TG、TC、LDL、年齡水平比較上，DPP-4 rs1558957 GG基因型和GC+CC基因型相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

表4 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型基本臨床資料的比較

2.5 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析由表5及圖2可見(jiàn)，DPP-4 rs1558957 GC+CC 基因型3年生存率及生存期與GG型相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.951，Z=1.369，P> 0.05)。

表5 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析

圖2 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型預(yù)后分析

2.6 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型與預(yù)后相關(guān)性分析由表6可見(jiàn)，DPP-4 rs1558957 GG、GC+CC基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性(P> 0.05)。

表6 DPP-4 rs1558957基因位點(diǎn)不同基因型與預(yù)后相關(guān)性分析

3 討論

DPP-4是一種130 kDa的免疫球蛋白(Ig)超家族成員，被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起作用，其潛在機(jī)制可能涉及炎癥。DPP-4可由CD4 + T細(xì)胞亞群，肥大細(xì)胞和B細(xì)胞分泌，其在控制感染、免疫的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用。作為炎癥反應(yīng)的放大器，DPP-4參與許多感染、炎癥疾病，包括過(guò)敏性紫癜，支氣管哮喘。DPP-4通過(guò)調(diào)節(jié)整合素介導(dǎo)細(xì)胞遷移并刺激整合素激活。一些研究發(fā)現(xiàn)DPP-4的多態(tài)性與心肌梗塞或急性冠狀動(dòng)脈綜合征，支氣管哮喘和嚴(yán)重瘧疾有關(guān)。研究表明，支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞DPP-4 mRNA水平上調(diào)。活化的DPP-4可通過(guò)影響Th1/Th2途徑介導(dǎo)支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制。此外，DPP-4基因多態(tài)性也與廣東人群中的鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。先前已經(jīng)研究了DPP-4(G2848A)基因多態(tài)性在霍奇金淋巴瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，結(jié)果表明DPP-4和MyD88的多態(tài)性和單倍型與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。然而，迄今為止的研究很少關(guān)注腦梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。rs1558965是位于DPP-4基因的密碼子563的外顯子8上的多態(tài)性，它導(dǎo)致從天冬酰胺到絲氨酸的變化。其在陽(yáng)離子結(jié)合中起重要作用。通過(guò)改變CD31的結(jié)構(gòu)或通過(guò)影響Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞相互作用，取代氨基酸可以影響與整聯(lián)蛋白的結(jié)合親和力；這可能會(huì)影響涉及細(xì)胞遷移，分化或細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，DPP-4 rs1558965基因位點(diǎn)AG+GG組3年生存率及生存期均明顯低于AA組，再根據(jù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Rs1558965多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后存在相關(guān)性。

研究已證明DPP-4 SNP rs1558965與T2DM相關(guān)，并且與sDPP-IV水平的變化相關(guān)。血脂異常是T2DM的常見(jiàn)特征，可通過(guò)測(cè)量載脂蛋白B(ApoB)水平進(jìn)行定量。最近的一項(xiàng)研究鑒定了南亞人群中與ApoB水平相關(guān)的DPP4基因的新SNP，發(fā)現(xiàn) DPP4 rs1558965 AA基因型與ApoB水平顯著相關(guān)。這在另一方面也提示，DPP4 rs1558965 AA基因型易導(dǎo)致ApoB水平升高，而ApoB做作為炎癥的預(yù)測(cè)因子，其代謝水平與多種炎癥標(biāo)志物如IL-6，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和CRP水平的增加有關(guān)。因此DPP4 rs1558965 AA基因型引起炎癥因子代謝紊亂這也可能是AA基因型是大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者不良預(yù)后的原因。本研究同時(shí)也探討了DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。而這些研究結(jié)果的定論需要在排除年齡、性別等混雜因素后才能確定，這將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

綜上所述，DPP4 rs1558965 AA基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后有相關(guān)性；DPP-4 rs1558957 GG、GC、CC基因型與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者預(yù)后的無(wú)相關(guān)性。本研究仍存在一定不足之處，由于本研究尚處于初步階段，受到時(shí)間及樣本數(shù)量限制，可能在某些結(jié)果統(tǒng)計(jì)上產(chǎn)生一定偏差，因此有必要在后續(xù)研究中延長(zhǎng)時(shí)間、擴(kuò)大樣本量，實(shí)施進(jìn)一步深入研究。