黏膜免疫反應與豬病預防用疫苗研究

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

大部分病原微生物都是通過黏膜途徑入侵動物機體，引起感染和發病，健康動物的黏膜可通過各種方式，發揮作用，抵御病原微生物的入侵，這些黏膜分布在與外界相通的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等表面[1-2]。黏膜及其周圍外分泌腺體的淋巴組織、全身血液和淋巴循環構成機體的黏膜免疫系統，同細胞免疫和體液免疫一樣發揮黏膜免疫功能，增強機體防病、抗病力[3-4]。黏膜免疫自出現以來，受到廣泛重視，與傳統體液和細胞免疫不同，黏膜免疫系統不僅局部產生具有分泌型的抗體，如分泌型的IgA（sIgA）、IgM（sIgM）和IgG等，在局部發揮作用阻斷病原入侵，還能促使全身黏膜免疫系統共同發揮作用，誘發全身免疫應答[5-6]。通常黏膜局部抗體出現時間比血清抗體早，持續時間長、效價高。

隨規模化養豬業的不斷發展，傳統注射免疫方式勞動強度大，需大量人力、物力，易交叉污染，造成豬只應激，急需采用新的免疫方式。黏膜免疫可通過氣霧、口服等途徑接種，對豬損害小，操作簡單，并能通過占位效應阻止病原在機體黏膜定植，發揮局部及全身免疫應答作用。近年來，黏膜免疫受到廣泛關注，是未來豬病免疫的主要方向。要想達到理想免疫效果需根據不同病原的入侵途徑，有針對性地進行研制相應疫苗，并配合專屬黏膜免疫佐劑，使得通過黏膜途徑免疫的疫苗發揮最大作用，更好地保護豬只健康。現就豬各種疾病黏膜免疫疫苗的研究進展進行綜述，以期為保護豬只健康提供思路。

1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）對哺乳仔豬的危害嚴重，尤其對7日齡仔豬，因腸上皮細胞更新速度慢，死亡率更高，通過母乳獲得的sIgA是仔豬抵抗病毒感染的關鍵。傳統的母豬肌注滅活疫苗不能產生sIgA，而接種弱毒疫苗后可能會因弱毒含量低或在腸道中的增值能力低或與當前流行毒株不匹配等問題，不能產生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母豬乳腺產生sIgA，sIgA在腸道中穩定性較好，可為仔豬提供被動免疫保護。Hou等構建了能表達PEDV N基因的重組乳酸桿菌，經口服和滴鼻免疫小鼠后，通過測定血清中的抗體IgG的含量來判定免疫效果，結果顯示，與對照組相比無論是口服免疫還是滴鼻免疫組小鼠，免疫效果幾乎無差別，都能產生良好的免疫應答反應；在免疫后70 d采集小鼠腸液，并在84 d收集小鼠肺液，分別用間接ELISA方法檢測黏膜抗體IgA的含量，結果表明，腸液和肺液中均能檢測到高含量的抗體水平，且這些抗體具有中和PEDV的活性[7]。葛俊偉等構建了表達PEDV COE基因的重組乳酸桿菌口服免疫小鼠，測定其免疫應答水平，結果表明，免疫組小鼠血清、糞便中檢測到較高水平的特異性IgG、sIgA（P＜0.01），血清具有中和活性（1∶12），脾淋巴細胞增殖指數明顯高于對照組，IL-4和IFN-γ水平極顯著提高（P＜0.01）[8]。

2 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是經腸道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入機體過程中具有重要作用。宋振輝等分別構建了含TGEV M及N基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，將兩種重組病毒分別口服免疫小鼠，收集小鼠糞便檢測sIgA抗體水平，并檢測血清中IgG，結果顯示，這兩種不同的重組病毒分別免疫小鼠后，均可以誘導小鼠機體產生良好的體液和黏膜免疫應答反應[9]。劉義等將含有TGEV S基因的重組乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加強免疫共免疫3次，每次免疫連續灌服3 d，間隔兩周，免疫劑量為0.3～0.4 mL·只-1，第3次加強免疫后10 d，捕殺小鼠，采集血液、脾臟、糞便，處理后采用T淋巴細胞增殖試驗及間接ELISA方法檢查免疫小鼠對外源基因表達產物的應答情況，結果表明，免疫組小鼠血清中的IgG、糞便中的sIgA與對照組有顯著差異（P＜0.05）[10]。

3 豬輪狀病毒病

輪狀病毒可引起各種幼齡動物腹瀉，也能導致嬰幼兒發病，是一種人獸共患病原體。對輪狀病毒感染所引起的胃腸炎沒有特效治療藥物，只能通過疫苗免疫預防。目前，人用的輪狀病毒疫苗可口服免疫，效果較好，豬輪狀病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。葉麗萍等構建了能表達輪狀病毒Vp4的重組乳酸菌，大量培養后離心，加入滅菌脫脂乳液給BALB/c小鼠灌服，檢測血清抗體和腸黏膜sIgA水平，并進行小鼠免疫保護性試驗，結果表明，該重組菌能增強小鼠的黏膜免疫反應，對豬輪狀病毒強毒株的攻擊具有一定的保護作用[11]。

4 豬偽狂犬病

由于偽狂犬病病毒并不引起毒血癥，而主要定植在三叉神經，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效應，從而抵抗野毒的感染。同時，黏膜免疫可以避免母源抗體對免疫產生的影響。用豬偽狂犬病病毒活疫苗在小豬1～3日齡噴鼻免疫，是豬場偽狂犬病凈化的第1步，能有效抵御偽狂犬病野毒的入侵。噴鼻免疫一定要操作正確，選用專用的噴鼻器，最好不要進行滴鼻免疫，滴鼻時只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通過吞咽反射進入胃內被胃酸滅活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相應的佐劑則能進一步提高黏膜免疫的效果。豬場在噴鼻免疫的基礎上再做1～2次肌肉注射免疫以建立細胞免疫，防控偽狂犬病。

5 豬支原體病

豬支原體能與相應的受體結合，并在黏膜部位的細胞內增殖，通過“占位效應”阻斷野毒的“入侵”。豬支原體活疫苗可噴鼻免疫，也可進行噴霧免疫操作，當噴霧免疫時一定要控制氣溶膠顆粒的大小，顆粒太大時，僅能到咽部，不能進入氣管及肺部，太小時，即使吸入體內也容易呼出，只有大小合適的顆粒才能在進入肺部并停留。另外，噴霧時一定要保持抗原的活性，否則就失去意義。氣霧免疫能否取得良好的效果，取決于兩個關鍵因素，即如何保證噴霧顆粒的大小合理及微生物活性的保持。鄭鵬等用豬肺炎支原體活疫苗免疫健康家兔，并添加相應佐劑以增強免疫效果，結果顯示，家兔免疫后均能產生良好的體液、細胞及黏膜免疫應答反應，尤其以CPG佐劑組效果最好[12]。

6 豬圓環病毒病防控

圓環病毒2型（PCV2）可經呼吸道、消化道、精液及胎盤等途徑傳播，能定植于黏膜系統（包括口鼻呼吸道、支氣管、肺及胃腸道黏膜）然后開始復制，并突破血液屏障進入血液循環和淋巴循環。傳統的圓環病毒2型疫苗肌肉注射，只能獲得體液免疫，無法阻止PCV2在黏膜系統的定植復制及向體外排毒，黏膜免疫產生sIgA可通過黏膜免疫中和病毒，全面清除機體中的病毒。英國皇家科學院用食用酵母菌為載體研制了圓環的口服疫苗為粉末狀風干重組酵母，可穩定地表達PCV2b的殼蛋白，在母豬腸道建立了黏膜保護，從而顯著降低豬只體內病毒含量，減少排毒，減輕臨床癥狀，使得糞便中IgA抗體和血清中IgG抗體水平顯著提高，從而降低了母豬圓環病毒2型的排毒感染壓力。

7 豬藍耳病防控

豬藍耳病病毒（PRRSV）可經呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑感染豬，通過黏膜免疫可阻斷其感染。吳國軍等研究表明，通過鼻腔黏膜途徑接種PRRS疫苗弱毒CH-1R株能顯著刺激動物機體產生良好的體液和黏膜免疫應答反應，從而對動物機體產生良好的保護作用[13]。Han等構建了表達PRRSV的ORF7基因重組減毒沙門氏菌，經口服免疫小鼠12周后，在腸系膜淋巴結、小腸黏膜下淋巴集結、固有層淋巴細胞都檢測到sIgA[14]。王振華等構建了表達PRRSV ORF6基因的重組乳酸桿菌，與黏膜佐劑CpG ODN聯合鼻內免疫BALB/c小鼠，評價其佐劑效應，結果表明，與單獨免疫佐劑和抗原組相比，免疫抗原配合CpG ODN佐劑組，血清中產生較高的IgG抗體水平，且呼吸道黏膜和腸道黏膜也能產生較高的sIgA水平抗體水平，其中呼吸道黏膜的sIgA水平抗體水平高于腸道黏膜。通過測定脾細胞懸液中細胞因子，比較各組細胞免疫效果，結果顯示，疫抗原配合CpG ODN佐劑組的IL-2、IFN-γ和IL-5活性均高于單獨免疫組（P＞0.05），與單獨佐劑組相比顯著升高（P＜0.01），但IL-4水平各組差異不顯著（P＞0.05）[15]。

8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）經消化道、呼吸道進入動物機體，首先在咽喉部和扁桃體增殖，隨后進入血液循環系統，因此黏膜免疫對預防口蹄疫具有重要意義。王瀟等分別構建了含FMDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重組核表達質粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，將兩種重組質粒同時或pcD-VP1單獨免疫小鼠，檢測免疫效果，結果顯示，與單獨接種pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐劑后可誘導更高水平的黏膜sIgA的表達及分泌，極大地提高了黏膜部位抗原特異性T細胞增殖反應及CD4+T細胞中IL-4的表達量[16]。張馨玉等將經殼聚糖包裹的口蹄疫核酸疫苗pcD-VP1制備成的納米顆粒，將納米顆粒和核酸疫苗同時分別經4種不同黏膜途徑如口服、滴鼻、直腸和生殖道等免疫小鼠，檢測免疫效果，納米顆粒滴鼻和直腸免疫組，納米顆粒較單獨核酸疫苗組產生抗體的高峰提前2周，但口服和生殖道免疫組，納米顆粒較單獨核酸疫苗組產生抗體水平并沒有提高，但生殖道和直腸免疫組，納米顆粒較單獨核酸疫苗組產生良好的細胞免疫應答反應[17]。

9 豬流感防控

豬流感病毒（SIV）主要經呼吸道黏膜途徑感染豬，因此，局部黏膜免疫力的提升，可阻止SIV對豬的感染。師小瀟等選擇SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，將多個表位片段串聯，克隆到原核表達載體pET-30a（+）中，對串聯表達的重組SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，經灌胃途徑免疫6周齡昆明小鼠，檢測免疫小鼠抗體及細胞免疫水平，結果發現，3免后各免疫組血清IgG抗體及黏膜sIgA抗體與對照組相比有著非常顯著的差異（P＜0.01），細胞免疫檢測顯示，所有免疫組小鼠外周血T淋巴細胞增殖明顯，SIV血凝抗體檢測結果顯示，SIV-ep1免疫組、SIV-ep2免疫組、SIVep1與LT蛋白免疫組抗SIV H1N1亞型HI效價達1∶1 024，SIV-el2蛋白免疫組HI效價達1∶512[18]。

10 小結

黏膜對主要經黏膜途徑入侵豬的病原體有較好的防控作用，與常規免疫相比，經黏膜途徑免疫操作簡便，省時省力，對豬應激及副作用小，能發揮占位效應，避免了潛伏期疾病的的人工接種感染，適合規模化養殖場應用。黏膜免疫不僅能形成局部免疫應答，還能誘導全身性細胞、體液和黏膜免疫應答反應，是未來豬用疫苗很有前景的一種免疫方式。為提高黏膜免疫效果，還要進行佐劑的篩選、免疫的途徑、抗原活性的最大保持及有效的利用等方面的研究。目前已有專家從豬體內分離出腸道定植的益生菌作為疫苗的載體，制備成可口服的疫苗，能使疫苗的效力達到最佳。隨著技術不斷發展，未來黏膜免疫一定會成為豬場的主流免疫方式。