豬繁殖與呼吸綜合征的研究進展

劉 賀，金 暉，陳 晨，姚鵬杰，祁思霖

（1.撫順市動物疫病預防控制中心，遼寧 撫順 113006；2.遼寧省動物及產品檢疫中心，沈陽 110115；3.朝陽市動物衛生監督所，遼寧 朝陽 122000）

豬繁殖和呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬RNA病毒病，該病以流產、產死胎和病弱仔豬，仔豬產出后因呼吸道疾病和繼發感染常常很快死亡為特征。1987年在美國首先發現本病[1]。由于病原不明確，便稱為豬神秘?。⊿MD），另有藍耳病、藍色流產、豬不孕與呼吸綜合征（SIRS）等名稱[2]。現在已經在大多數歐洲國家及部分亞洲國家發現，我國在1996年首先由郭寶清報告本病[3]。其造成豬的繁殖與呼吸障礙，給國內的養豬業造成了巨大的損失，嚴重威脅我國的動物衛生安全，對本病開展研究具有重要的現實意義。

1 病原學

PRRSV屬于套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬[4]。該病毒是一種直徑50～70 nm有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組序列已經明確。對豬的肺泡巨噬細胞具有高度嗜性。PRRSV可分為2個亞群，即歐洲型（A亞群）和美洲型（B亞群）。由于PRRS的基因突變、病毒基因重組及連續的基因異變，加之病毒株之間的競爭和免疫壓力選擇，PRRSV存在較大的基因變異，個別分離株的毒力、抗原性差異較大。我國發生的PRRS，經全序列測序表明是美洲型。PRRSV對寒冷具有較強的抵抗力，對高溫和化學藥品的抵抗力較弱。病毒在-70℃可保存18個月，4℃可保存1個月，37℃48 h，56℃45 min完全失去感染力，對乙醚和氯仿敏感。

2 臨床癥狀及病理變化

本病自然感染潛伏期一般為14 d。臨床表現為：母豬病初精神倦怠、厭食、發燒，妊娠中、后期發生早產、流產、死胎、木乃伊胎、弱胎、產奶量下降、不發情或屢配不孕。感染仔豬以2～28日齡的癥狀最為明顯，死亡率常達80%。早產仔豬多數24 h內死亡，多表現為腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、后肢麻痹、打噴嚏、嗜睡、耳朵發紺。剖檢常見淋巴結不同程度出血和壞死變化，肺臟病變初間質增寬呈水腫狀、之后出現瘀斑和實變，肝臟淤血、變性、腫大，脾臟腫大、出血性梗死，腎臟腫大、變性。育肥豬臨床癥狀不明顯，主要病變為間質性肺炎。

近年來，本病發生后常繼發或并發一些病毒病或細菌病。趙國明等發現，PRRS可與豬偽狂犬?。≒R）混合感染[5]。湯景元等從某規?；B殖場送檢的3頭患病仔豬分離出了PRRSV和致病性沙門氏菌[6]。母安雄等根據豬群發病情況、臨床癥狀、剖檢和實驗室檢查確診為豬流感并發PRRS[7]。陳紹柏也曾報道過豬藍耳?。≒RRS）與豬瘟混合感染[8]。

3 實驗室診斷

獸醫工作者和科研人員在原有的診斷方法的基礎上開發了很多的新的PRRSV的診斷技術，對PRRS的預防和及時治療具有重大的意義。

3.1 血清學檢驗法

3.1.1 免疫過氧化物酶單層細胞實驗

免疫過氧化物酶單層細胞試驗是目前常用的檢驗血清中PRRS抗體的方法。微量滴定板加巨噬細胞，5%CO237℃孵育18～24 h，將含105TCID50（半數組織培養感染量）·mL-1的病毒懸液50μL加入每孔，5%CO237℃孵育18～24 h，棄去培養液，用鹽水沖洗培養板，置37℃干燥45 min后-20℃冷凍45 min。玻片上黏附的細胞用含4%多聚甲醛PBS處理，室溫放置10 min，鹽水沖洗。加入1∶10稀釋的被檢血清（稀釋用含4%馬血清和0.5%吐溫-80的0.2 M NaCl），37℃孵育1 h，沖洗。加入兔抗豬HRPO結合物50μL，封板37℃孵育1 h。顯色液/底物（AEC）染色鏡檢，血清內存在抗體，則巨噬細胞胞質被染成深紅色[9]。

3.1.2 酶聯免疫吸附實驗

有研究報道，用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）取代IPMA，該方法敏感性、特異性和符合率均高于IPMA。法國已將ELISA作為檢測和診斷本病的常規方法。徐引弟等采用IDEXX公司生產的ELISA試劑盒對湖北、湖南、福建、浙江等省的大中型豬場豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）的流行情況進行了血清學檢查，都檢查出了很高的陽性率[10]。目前開發的試劑盒采用的歐洲型或美洲型病毒，或者采用這兩種抗原，具有迅速處理大批血清樣品的特點。

3.1.3 間接熒光抗體實驗

盡管現在無一個標準的公認的免疫熒光檢測方法，但在北美洲的實驗室研發出若干方案并已被采用。1～10周齡仔豬感染后7 d產生抗體，8 d IFA 滴度在 1∶20～1∶320，4周均為陽性，滴度＞1∶2 560，而且大部分豬的抗體滴度至少為1∶1 280。尹訓南等用IFA對人工接種PRRSV的8頭30日齡豬進行體內定位檢測，結果表明，特異性熒光細胞出現的頻度、數量及熒光度以肺臟最為明顯，特異性熒光主要出現在巨嗜細胞及血管內皮細胞的胞漿中。值得關注的是，不同實驗室IFA判斷標準會有不同，在一定程度上檢測結果判定取決于所用的毒株。

3.2 PCR檢測方法

3.2.1 反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法

有研究用RT-PCR建立一種直接檢測PRRS病毒的方法。以RT-PCR法擴增從西班牙分離的7株病毒的312 bp片段，進行克隆和測序，有96%～97%序列與PRRSV的核甘酸序列相同。有研究用PCR法能檢測出在細胞培養物中，或精液中30個感染單位（TCID）的PRRS病毒。Guarino等根據美洲株的（ATCCVR-2332）的ORFs4、6、7和Lelystad毒株的ORF1b設計了6對引物，對來自美洲的24個PRRS病毒進行了RT-PCR的擴增，其中保守性強的ORF7基因檢出率為100%。Madsen等用RT-PCR方法對分離自丹麥某豬場的血清進行檢測，通過對病毒核甘酸序列ORF2-ORF7的分析發現，其序列與VR-2332序列的同源性為99.2%～99.5%，從而判定此株病毒是PRRSV的一種變異株[11]。徐宜強等參考國內外已發表PRRSV的基因序列及相關的RT-PCR檢測方法報道，根據PRRSV高度保守、高特異性的NP蛋白基因設計了一對引物，建立了PRRSV RT-PCR檢測方法[12]。

3.2.2 逆轉錄環介導恒等溫擴增實驗

LAMP是由Notomi等發明的一種用于病毒檢測的核酸擴增技術，因其敏感、高效和便捷，被應用到很多常見疫病的檢測[13]。鄧顯文等利用NSP2基因的RT-LAMP檢測方法，敏感性高于常規PCR10倍[14]。曾少靈等構建的美洲型PRRSV及其高致病性變異株RT-LAMP檢測方法應用檢測58份病料，其結果與實時熒光RT-PCR方法檢測符合率100%[15]。該方法操作簡單且易于判定，適合基層和現場開展檢測，但是其氣溶膠污染值需高度關注，應做好檢測環境分區和定期通風，避免假陽性出現。

3.2.3 數字PCR

數字PCR是基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，不依賴Ct值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。其采取分析化學領域的微流控方法，將大量稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微反應器中，每個反應器的DNA模板數≤1個，這樣經過PCR循環之后，當不存在任何靶標序列時，沒有信號累積，進而推算出原始溶液的DNA濃度。數字PCR為PRRSV酸檢測方面提供了新的檢測平臺，亟待利用該平臺構建新的檢測方法。

4 防治

4.1 PRRS疫苗

近年來，PRRS的滅活苗、弱毒苗和基因工程苗的研究取得了很大的進展，并通過合理的選擇和使用免疫佐劑，如γ干擾素，霍亂毒素及可溶性β-葡萄糖等來改進疫苗的作用。Planadurán等報道，應用西班牙毒株研制成一種滅活苗，對后備母豬和母豬進行兩次免疫，有很好的保護作用[16]。滅活苗存在安全性，但是存在使用劑量大、成本高的問題。Schering-Plough公司發明了用于能繁母豬配種前3～6周使用的的弱毒苗[17]。弱毒疫苗在給豬群接種后，不僅可導致豬的病毒血癥，而且還可能通過分泌物向外排毒[18]。Clung等提出接種公豬可通過精液排毒[19]。更為嚴重的是，弱毒株的疫苗會發生返祖現象，轉變為強毒株，1996年丹麥弱毒苗免疫的豬群爆發PRRS[20]。因此，弱毒苗對PRRS陰性場、妊娠母豬、種公豬禁止使用。正因為弱毒苗和滅活苗存在這樣和那樣的問題，科研人員研發了采取腺病毒或偽狂犬病病毒為載體來表達PRRSV的主要免疫源性特性的多價基因工程苗和針對PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗及優化的疫苗，為PRRS安全防控提供了新的技術手段。

4.2 飼養管理與環境控制

應提高日糧營養水平，保證維生素（VE，生物素）、礦物質5%～10%（Fe、Ca、I、Se、Mn等）含量，注意氨基酸的平衡。保持環境衛生，消毒徹底，防止PRRSV再次感染。注意保溫，當溫度過低、過高、風速大和紫外線照射強度過大時，PRRS傳染和傳播的幾率會增大。后備母豬和育成豬混合飼養，或者隔離不徹底，可能引起交叉感染。做好引種隔離、人員流動控制和血清學監測，有助于預防本病。