蛋白質(zhì)組學(xué)在魚肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用

王 琨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150028）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類對動物蛋白的消費(fèi)需求呈上升趨勢，同時(shí)也對食物品質(zhì)提出了更高的要求。作為富含較高蛋白質(zhì)的魚類已成為人類飲食中可獲得的極其重要的蛋白質(zhì)來源，其品質(zhì)的研究也成為了近幾年國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。在魚類中，最好的品質(zhì)是緊實(shí)且具有良好水分保持能力的肉質(zhì)，這些性狀主要是由機(jī)體蛋白質(zhì)的本質(zhì)和屬性決定的。食品基質(zhì)的構(gòu)建，無論是在細(xì)胞和組織范圍內(nèi)，都是由蛋白質(zhì)調(diào)控的[1]。因此，需要可靠的技術(shù)分析水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，以提高水產(chǎn)品品質(zhì)。隨著后基因組時(shí)代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在蛋白質(zhì)水平上篩選出與肉質(zhì)有關(guān)的標(biāo)記蛋白，為探索肉類品質(zhì)形成的影響因素提供了新的研究視角。雖然，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用仍處于初級階段，其進(jìn)展將比基因組測序速度慢，但已經(jīng)展現(xiàn)較好的前景。本文對蛋白質(zhì)組學(xué)的定義、“經(jīng)典”研究方法以及在魚肉品質(zhì)研究的應(yīng)用進(jìn)行簡要綜述，以期為今后魚類肉質(zhì)改良提供參考。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[2]。與基因組不同的是，蛋白質(zhì)易受環(huán)境影響，也隨時(shí)間的變化在組織中各不相同，具有動態(tài)性[3]。目前認(rèn)為是蛋白質(zhì)組是特定時(shí)刻已知細(xì)胞、組織或者器官所有的蛋白質(zhì)（包括亞型和修飾蛋白質(zhì)）[4]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)是通過了解蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能、相互作用和聯(lián)系及其動態(tài)變化規(guī)律，最終從生物體生理特點(diǎn)解釋遺傳與環(huán)境如何影響生物功能。

二維凝膠電泳（2-DE）是最廣泛使用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，因?yàn)槠浜唵巍⒖煽?，而且相對?shí)惠。該技術(shù)是基于蛋白質(zhì)等電聚焦（IEF）和相對分子質(zhì)量不同進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，可一次分離出數(shù)百甚至上千種蛋白質(zhì)[5]。這種技術(shù)分辨率高，對未經(jīng)處理的樣品耐受性好，可以在一個特性的細(xì)胞或組織中分離出更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)，使其成為可靠的最佳實(shí)驗(yàn)工具之一。因此，其適合全面分析器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而2-DE也有一些缺點(diǎn)，例如不能將復(fù)雜（組織）樣本中的所有蛋白質(zhì)可視化，一些低豐度的蛋白不易檢測，其中包括許多關(guān)鍵細(xì)胞信號元件和轉(zhuǎn)錄因子，凝膠回收率不穩(wěn)定，并且這種方法也是凝膠蛋白組學(xué)技術(shù)以填補(bǔ)2-DE留下的空白或完全消除凝膠技術(shù)（包括酵母雙雜交和反向雜交兩種測定法）以及同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)、噬菌體抗體庫、蛋白質(zhì)微陣列和多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)等方法[6-11]。上述方法不僅克服2D電泳的部分缺點(diǎn)，還具備以下優(yōu)點(diǎn)：大規(guī)模蛋白表達(dá)和描述，消除蛋白質(zhì)分離過程中耗時(shí)的步驟，高靈敏度和小樣本量的要求及肽分離的通用機(jī)制。然而，這些技術(shù)的改進(jìn)和相關(guān)過程目前仍存在局限性，對未來仍是一個挑戰(zhàn)[12]。因此，2-DE技術(shù)仍然在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。

質(zhì)譜法在生命科學(xué)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析，在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用2-DE等分離技術(shù)后，在蛋白質(zhì)的高通量識別鑒定起到重要作用[13]。質(zhì)譜儀包括3個基本組成成分（離子源、質(zhì)量分析儀和離子探測器），具有極高的靈敏度。20世紀(jì)80年代末，研究人員采用基質(zhì)輔助激光電離（MALDI）和電噴霧電離（ES）這兩種軟電離技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中，推動了生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展[14]。事實(shí)上，基于質(zhì)譜技術(shù)（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，根據(jù)Guerrera等的說法，MS是幾乎所有蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心，因?yàn)槠涮峁┝说鞍踪|(zhì)分析的關(guān)鍵工具——其獨(dú)特的重量，但對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)來說，不是整個蛋白質(zhì)的質(zhì)量，而是由酶分解產(chǎn)生的肽的質(zhì)量[15]。因此，質(zhì)譜分析技術(shù)仍有一定的缺點(diǎn)，比如不能區(qū)分幾種特殊氨基酸，有些固有序列不能測定等。隨著基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量鑒定蛋白質(zhì)相對定量已經(jīng)成為可能，復(fù)雜混合物中單個肽的絕對定量已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)，高度修飾后的蛋白質(zhì)可以完全進(jìn)行質(zhì)譜分析[16-18]。然而，在今后蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是在復(fù)雜的樣品研究中的靈敏度提升、整個蛋白質(zhì)測定的新方法、動態(tài)顯示和檢測蛋白質(zhì)的范圍等。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用

與其他食品相比，魚類質(zhì)量評估受到越來越多的關(guān)注和更多的研究。將蛋白質(zhì)組技術(shù)應(yīng)用于魚肉品質(zhì)研究的主要目標(biāo)是獲取魚肉品質(zhì)變化中蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，從全新的角度來分析與肉質(zhì)相關(guān)的問題，有望達(dá)到改良肉質(zhì)的目的[19]。一般來說，魚類肉質(zhì)除了由遺傳因素決定，還受“魚類福利”、食物組成與營養(yǎng)水平及死后加工方式、貯存溫度等多因素影響。但無論何種因素，最終都是取決于肌肉組織自身的生化代謝改變結(jié)構(gòu)特性，如嫩度、多汁性、肌內(nèi)脂肪含量和肌纖維特性[20]。

2.1 “魚類福利”影響

魚類福利可通過表觀、生長狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、動物行為和死亡率等生理指標(biāo)來評價(jià)。許多學(xué)者研究認(rèn)為，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變或受到壓力等影響，魚類會出現(xiàn)繁殖能力下降、生長周期變長，甚至死亡率上升等變化。從這個意義上講，“魚類福利”可以直接影響魚類在生長期間的質(zhì)量。Veiseth-Ken在受到40 min擁擠壓力的大西洋鮭Salmo salar肌肉中發(fā)現(xiàn)了27個蛋白質(zhì)點(diǎn)，包括結(jié)構(gòu)蛋白（即原肌球蛋白、肌動蛋白、重鏈肌球蛋白和輕鏈肌球蛋白）和肌質(zhì)蛋白[21]。另一方面，大西洋鮭血漿載脂蛋白AI降低，血管緊張素原補(bǔ)體成分C3含量增高，所有這些蛋白質(zhì)都參與不同的二級和三級應(yīng)激反應(yīng)，改變能量代謝，滲透調(diào)節(jié)和免疫功能，這種變化不僅與魚類的生理應(yīng)激反應(yīng)相對應(yīng)，還導(dǎo)致肌肉pH下降，從而影響水產(chǎn)制品品質(zhì)變化。Morzel等研究了兩種不同的屠宰程序，以宰殺前15 min高密度聚集與對照組相比，研究虹鱒肌肉蛋白質(zhì)的變化，在試驗(yàn)過程中，使用雙向電泳分離蛋白質(zhì)，并通過MALDI-TOF光譜法鑒定目標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在死后45 min和24 h分別在兩組魚之間差異地顯示了29和4個蛋白質(zhì)點(diǎn)，鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)主要對應(yīng)于能量產(chǎn)生途徑（磷酸丙糖異構(gòu)酶、烯醇酶、丙酮酸脫氫酶）或結(jié)構(gòu)蛋白（結(jié)蛋白、cap-Z、肌球蛋白重鏈片段）中涉及的蛋白質(zhì)[22]。因此，魚類在宰殺前受到強(qiáng)烈肌肉活動對魚的肌肉完整性及質(zhì)構(gòu)特性也會產(chǎn)生不良影響。王彥波等研究不同宰殺方式對鯽魚肌肉質(zhì)構(gòu)和蛋白質(zhì)組的影響，結(jié)果表明，致死方式影響鯽魚肌肉中蛋白質(zhì)的含量與代謝，表現(xiàn)為肌肉的硬度、咀嚼性和膠黏性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)發(fā)生變化[23]。此外，魚類生長環(huán)境的不同也會對魚類的感官和質(zhì)構(gòu)特性產(chǎn)生較大的影響，這在一些研究中也得到證實(shí)[24-26]。由此可見，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究有肉質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)的表征及動態(tài)變化，易于從分子水平上揭示“魚類福利”對水產(chǎn)動物品質(zhì)影響機(jī)制，為魚類養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

2.2 飼料組成

毫無疑問，魚體肌肉營養(yǎng)成分是衡量魚肉質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是消費(fèi)者關(guān)注的問題。影響魚類肌肉營養(yǎng)成分的主要因素是飼料，飼料的組成成分會對機(jī)體成分產(chǎn)生一定的影響。當(dāng)魚類食用某些有異味物質(zhì)的飼料，在肌肉中的殘留達(dá)到一定濃度時(shí)，就會影響魚類肉質(zhì)的風(fēng)味。蛋白質(zhì)組學(xué)在研究飼料成分對魚類代謝影響方面發(fā)揮重要作用。Rufino等通過研究分析在魚類養(yǎng)殖過程中加入飼料添加劑山楂酸與對照組比較的金頭鯛幼魚的肝臟中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)信息，結(jié)果表明，飼料添加劑可刺激魚類的生長，影響魚肉的質(zhì)量[27]。Martin等使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究虹鱒肝臟的蛋白質(zhì)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂不同日糧的魚的蛋白質(zhì)生長率沒有差異；然而，飼喂大豆蛋白質(zhì)越多，魚的蛋白質(zhì)消耗越快而結(jié)構(gòu)蛋白合成效率較低，氨的排泄增加以及肝谷氨酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ASAT）的活性增加，導(dǎo)致虹鱒的代謝變化，影響魚肉的品質(zhì)[28]。

2.3 死后代謝機(jī)制

魚類死后的加工方式和貯藏會影響肉質(zhì)，魚肉產(chǎn)品貯藏加工過程中由于蛋白水解導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生改變，肉質(zhì)變軟，同時(shí)伴有細(xì)菌腐敗，最終影響水產(chǎn)品品質(zhì)。很多研究表明，鈣蛋白酶和組織蛋白酶降解肌原纖維，基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)絲氨酸對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，這些生化反應(yīng)發(fā)生的過程被認(rèn)為是肉質(zhì)變化的主要原因之一，然而該過程更多的細(xì)節(jié)仍然未知。Kjaersgard等利用2-DE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮的鱈魚比較，死后鱈魚肌肉有11個蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生了變化，其中8個蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度顯著增加，分析表明這些蛋白質(zhì)點(diǎn)是肌肉組織的部分分解產(chǎn)物。還發(fā)現(xiàn)，有11個蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生顯著變化，其中9個蛋白質(zhì)強(qiáng)度增加，并且對于其中8個，在死后的前2 h內(nèi)增加顯著（P＜0.05）[30]。相反，強(qiáng)度降低的兩個蛋白質(zhì)點(diǎn)在8 d后顯示顯著變化（P＜0.05），從而表明在魚類死魚肉生化反應(yīng)過程是由蛋白質(zhì)變化導(dǎo)致。因此，應(yīng)用基于2-DE的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的對于更深入的研究魚類死亡后新陳代謝分子機(jī)制與肉質(zhì)變化之間的關(guān)聯(lián)性具有重要價(jià)值。

3 研究展望

以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為手段對水產(chǎn)品品質(zhì)的研究報(bào)道逐年增加，但在實(shí)際的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)組學(xué)還是沒有得到更廣泛的應(yīng)用[31-32]。尤其是什么方法最適合于魚類樣品的蛋白質(zhì)組分析，如何驗(yàn)證不同實(shí)驗(yàn)室使用現(xiàn)有技術(shù)確定的相關(guān)結(jié)果，以及蛋白質(zhì)表達(dá)變化的預(yù)測因子等方面仍有很大的研究空間。未來，各種操作簡便、靈敏性高等更具成本效益技術(shù)的發(fā)展，將進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的價(jià)值，在水產(chǎn)動物研究中扮演越來與重要的角色[33]。隨著魚類蛋白質(zhì)組信息數(shù)據(jù)庫的不斷增加，同時(shí)與其他學(xué)科加強(qiáng)合作，包括生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品工業(yè)等，必將為在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域改進(jìn)、增加甚至創(chuàng)造相關(guān)產(chǎn)品提供新機(jī)遇。