蛋白質組學在魚肉品質研究中的應用

王 琨

（哈爾濱商業大學，哈爾濱 150028）

據統計，人類對動物蛋白的消費需求呈上升趨勢，同時也對食物品質提出了更高的要求。作為富含較高蛋白質的魚類已成為人類飲食中可獲得的極其重要的蛋白質來源，其品質的研究也成為了近幾年國內外學者的研究熱點。在魚類中，最好的品質是緊實且具有良好水分保持能力的肉質，這些性狀主要是由機體蛋白質的本質和屬性決定的。食品基質的構建，無論是在細胞和組織范圍內，都是由蛋白質調控的[1]。因此，需要可靠的技術分析水產品中的蛋白質，以提高水產品品質。隨著后基因組時代的到來，蛋白質組學技術可以在蛋白質水平上篩選出與肉質有關的標記蛋白，為探索肉類品質形成的影響因素提供了新的研究視角。雖然，在水產養殖中，蛋白質組學技術的應用仍處于初級階段，其進展將比基因組測序速度慢，但已經展現較好的前景。本文對蛋白質組學的定義、“經典”研究方法以及在魚肉品質研究的應用進行簡要綜述，以期為今后魚類肉質改良提供參考。

1 蛋白質組學

蛋白質組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組表達的所有蛋白質[2]。與基因組不同的是，蛋白質易受環境影響，也隨時間的變化在組織中各不相同，具有動態性[3]。目前認為是蛋白質組是特定時刻已知細胞、組織或者器官所有的蛋白質（包括亞型和修飾蛋白質）[4]。因此，蛋白質組學的目標是通過了解蛋白質性質、功能、相互作用和聯系及其動態變化規律，最終從生物體生理特點解釋遺傳與環境如何影響生物功能。

二維凝膠電泳（2-DE）是最廣泛使用的蛋白質組學方法，因為其簡單、可靠，而且相對實惠。該技術是基于蛋白質等電聚焦（IEF）和相對分子質量不同進行蛋白質分離，可一次分離出數百甚至上千種蛋白質[5]。這種技術分辨率高，對未經處理的樣品耐受性好，可以在一個特性的細胞或組織中分離出更多的蛋白質點，使其成為可靠的最佳實驗工具之一。因此，其適合全面分析器官中蛋白質的表達。然而2-DE也有一些缺點，例如不能將復雜（組織）樣本中的所有蛋白質可視化，一些低豐度的蛋白不易檢測，其中包括許多關鍵細胞信號元件和轉錄因子，凝膠回收率不穩定，并且這種方法也是凝膠蛋白組學技術以填補2-DE留下的空白或完全消除凝膠技術（包括酵母雙雜交和反向雜交兩種測定法）以及同位素標記親和標簽技術、噬菌體抗體庫、蛋白質微陣列和多維蛋白質鑒定技術等方法[6-11]。上述方法不僅克服2D電泳的部分缺點，還具備以下優點：大規模蛋白表達和描述，消除蛋白質分離過程中耗時的步驟，高靈敏度和小樣本量的要求及肽分離的通用機制。然而，這些技術的改進和相關過程目前仍存在局限性，對未來仍是一個挑戰[12]。因此，2-DE技術仍然在蛋白質組學研究中發揮著重要作用。

質譜法在生命科學中被廣泛應用于蛋白質分析，在蛋白質組學中應用2-DE等分離技術后，在蛋白質的高通量識別鑒定起到重要作用[13]。質譜儀包括3個基本組成成分（離子源、質量分析儀和離子探測器），具有極高的靈敏度。20世紀80年代末，研究人員采用基質輔助激光電離（MALDI）和電噴霧電離（ES）這兩種軟電離技術應用到蛋白質的結構分析中，推動了生物質譜技術的發展[14]。事實上，基于質譜技術（MS）的蛋白質組學是蛋白質組學研究的關鍵技術之一，根據Guerrera等的說法，MS是幾乎所有蛋白質組學實驗的核心，因為其提供了蛋白質分析的關鍵工具——其獨特的重量，但對于大多數實驗來說，不是整個蛋白質的質量，而是由酶分解產生的肽的質量[15]。因此，質譜分析技術仍有一定的缺點，比如不能區分幾種特殊氨基酸，有些固有序列不能測定等。隨著基于MS的蛋白質組學技術的發展，高通量鑒定蛋白質相對定量已經成為可能，復雜混合物中單個肽的絕對定量已經能夠實現，高度修飾后的蛋白質可以完全進行質譜分析[16-18]。然而，在今后蛋白質組學的研究中，仍然面臨著諸多挑戰，尤其是在復雜的樣品研究中的靈敏度提升、整個蛋白質測定的新方法、動態顯示和檢測蛋白質的范圍等。

2 蛋白質組學技術在魚肉品質研究中的應用

與其他食品相比，魚類質量評估受到越來越多的關注和更多的研究。將蛋白質組技術應用于魚肉品質研究的主要目標是獲取魚肉品質變化中蛋白質的作用機制，從全新的角度來分析與肉質相關的問題，有望達到改良肉質的目的[19]。一般來說，魚類肉質除了由遺傳因素決定，還受“魚類福利”、食物組成與營養水平及死后加工方式、貯存溫度等多因素影響。但無論何種因素，最終都是取決于肌肉組織自身的生化代謝改變結構特性，如嫩度、多汁性、肌內脂肪含量和肌纖維特性[20]。

2.1 “魚類福利”影響

魚類福利可通過表觀、生長狀態、應激反應、動物行為和死亡率等生理指標來評價。許多學者研究認為，當環境發生改變或受到壓力等影響，魚類會出現繁殖能力下降、生長周期變長，甚至死亡率上升等變化。從這個意義上講，“魚類福利”可以直接影響魚類在生長期間的質量。Veiseth-Ken在受到40 min擁擠壓力的大西洋鮭Salmo salar肌肉中發現了27個蛋白質點，包括結構蛋白（即原肌球蛋白、肌動蛋白、重鏈肌球蛋白和輕鏈肌球蛋白）和肌質蛋白[21]。另一方面，大西洋鮭血漿載脂蛋白AI降低，血管緊張素原補體成分C3含量增高，所有這些蛋白質都參與不同的二級和三級應激反應，改變能量代謝，滲透調節和免疫功能，這種變化不僅與魚類的生理應激反應相對應，還導致肌肉pH下降，從而影響水產制品品質變化。Morzel等研究了兩種不同的屠宰程序，以宰殺前15 min高密度聚集與對照組相比，研究虹鱒肌肉蛋白質的變化，在試驗過程中，使用雙向電泳分離蛋白質，并通過MALDI-TOF光譜法鑒定目標，結果發現，在死后45 min和24 h分別在兩組魚之間差異地顯示了29和4個蛋白質點，鑒定出的蛋白質點主要對應于能量產生途徑（磷酸丙糖異構酶、烯醇酶、丙酮酸脫氫酶）或結構蛋白（結蛋白、cap-Z、肌球蛋白重鏈片段）中涉及的蛋白質[22]。因此，魚類在宰殺前受到強烈肌肉活動對魚的肌肉完整性及質構特性也會產生不良影響。王彥波等研究不同宰殺方式對鯽魚肌肉質構和蛋白質組的影響，結果表明，致死方式影響鯽魚肌肉中蛋白質的含量與代謝，表現為肌肉的硬度、咀嚼性和膠黏性等質構指標發生變化[23]。此外，魚類生長環境的不同也會對魚類的感官和質構特性產生較大的影響，這在一些研究中也得到證實[24-26]。由此可見，利用蛋白質組學研究有肉質相關的蛋白質的表征及動態變化，易于從分子水平上揭示“魚類福利”對水產動物品質影響機制，為魚類養殖環境的優化提供理論依據。

2.2 飼料組成

毫無疑問，魚體肌肉營養成分是衡量魚肉質量的重要指標，也是消費者關注的問題。影響魚類肌肉營養成分的主要因素是飼料，飼料的組成成分會對機體成分產生一定的影響。當魚類食用某些有異味物質的飼料，在肌肉中的殘留達到一定濃度時，就會影響魚類肉質的風味。蛋白質組學在研究飼料成分對魚類代謝影響方面發揮重要作用。Rufino等通過研究分析在魚類養殖過程中加入飼料添加劑山楂酸與對照組比較的金頭鯛幼魚的肝臟中差異表達的蛋白質信息，結果表明，飼料添加劑可刺激魚類的生長，影響魚肉的質量[27]。Martin等使用蛋白質組學方法研究虹鱒肝臟的蛋白質特征，結果發現，飼喂不同日糧的魚的蛋白質生長率沒有差異；然而，飼喂大豆蛋白質越多，魚的蛋白質消耗越快而結構蛋白合成效率較低，氨的排泄增加以及肝谷氨酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉移酶（ASAT）的活性增加，導致虹鱒的代謝變化，影響魚肉的品質[28]。

2.3 死后代謝機制

魚類死后的加工方式和貯藏會影響肉質，魚肉產品貯藏加工過程中由于蛋白水解導致質構特性發生改變，肉質變軟，同時伴有細菌腐敗，最終影響水產品品質。很多研究表明，鈣蛋白酶和組織蛋白酶降解肌原纖維，基質金屬蛋白酶和基質絲氨酸對細胞外基質的降解，這些生化反應發生的過程被認為是肉質變化的主要原因之一，然而該過程更多的細節仍然未知。Kjaersgard等利用2-DE技術研究發現，與新鮮的鱈魚比較，死后鱈魚肌肉有11個蛋白質點的豐度發生了變化，其中8個蛋白質點的豐度顯著增加，分析表明這些蛋白質點是肌肉組織的部分分解產物。還發現，有11個蛋白質點的豐度發生顯著變化，其中9個蛋白質強度增加，并且對于其中8個，在死后的前2 h內增加顯著（P＜0.05）[30]。相反，強度降低的兩個蛋白質點在8 d后顯示顯著變化（P＜0.05），從而表明在魚類死魚肉生化反應過程是由蛋白質變化導致。因此，應用基于2-DE的蛋白質組學技術的對于更深入的研究魚類死亡后新陳代謝分子機制與肉質變化之間的關聯性具有重要價值。

3 研究展望

以蛋白質組學技術為手段對水產品品質的研究報道逐年增加，但在實際的水產養殖中，蛋白質組學還是沒有得到更廣泛的應用[31-32]。尤其是什么方法最適合于魚類樣品的蛋白質組分析，如何驗證不同實驗室使用現有技術確定的相關結果，以及蛋白質表達變化的預測因子等方面仍有很大的研究空間。未來，各種操作簡便、靈敏性高等更具成本效益技術的發展，將進一步提高蛋白質組學技術在水產養殖領域的價值，在水產動物研究中扮演越來與重要的角色[33]。隨著魚類蛋白質組信息數據庫的不斷增加，同時與其他學科加強合作，包括生理學、細胞生物學和計算機科學，以及水產養殖和食品工業等，必將為在水產養殖領域改進、增加甚至創造相關產品提供新機遇。