禽偏肺病毒病原學(xué)及病毒分離鑒定

宇 凌，王 強(qiáng)，玄振盈，董翠梅，魏中鋒*

（1.山東省菏澤市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 菏澤 274000；2.山東省泰安市岱岳區(qū)山口鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東 泰安 271000；3.山東省泰安市岱岳區(qū)祝陽(yáng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東 泰安 271000）

禽偏肺病毒（aMPV）亦稱火雞鼻氣管炎病毒（TRTV），屬于副粘病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬，該病毒是有囊膜，不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。Buys等在1978年從南非火雞的鼻竇分泌物中首次分離出病原體[1]。隨后歐洲、北美洲和亞洲相繼報(bào)道了該病的存在。20世紀(jì)80年代以后，又從出現(xiàn)呼吸道癥狀、并伴有腫頭的病雞中分離到了aMPV病原體。除澳大利亞外，世界上所有主要家禽飼養(yǎng)地區(qū)均有報(bào)道有aMPV感染[2]。中國(guó)于1998年由沈瑞忠等首次報(bào)道了aMPV的存在。感染該病毒的火雞會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，并且在火雞養(yǎng)殖業(yè)，aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，aMPV是導(dǎo)致雞群腫頭綜合征的主要誘因之一，但其作為一種主要病原體的機(jī)理尚不清楚，雞只感染時(shí)會(huì)出現(xiàn)臉面腫脹，剖檢腫脹處有黃色干酪物。aMPV的感染率高達(dá)50%～100%，死亡率2%，出現(xiàn)與細(xì)菌或病毒的混合感染時(shí)，死亡率達(dá)到25%，aMPV感染給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

1 aMPV的病原學(xué)

1.1 aMPV的病原學(xué)特性

aMPV屬于副粘病毒科、肺病毒亞科，肺病毒亞科又可分為肺病毒屬和偏肺病毒屬，偏肺病毒屬包括aMPV和人偏肺病毒（hMPV）[4]。aMPV基因組全長(zhǎng)為13.1～14.2 kb，基因組編碼N-P-M-FM2-SH-G-L8蛋白。aMPV雖然有促進(jìn)細(xì)胞融合的F蛋白，但其糖蛋白（G）中沒(méi)有神經(jīng)氨酸酶活性，因此這些病毒不具有血凝作用，這也是區(qū)別于其他副粘病毒的一個(gè)重要特征[5]。在負(fù)染電鏡下，aMPV呈直徑為50～200 nm的高度多形性顆粒，通常是球形，也會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)度＞1 000 nm纖絲，特別是在器官培養(yǎng)繁殖的傳代中。其核衣殼呈螺旋狀，病毒粒子表面會(huì)有13～14nm的纖突[6]。

1.2aMPV的分類

根據(jù)遺傳進(jìn)化分析和抗原變異，aMPV共被分為A、B、C和D 4個(gè)亞型[7-9]。A和B亞型的aMPV存在于除北美和澳大利亞之外的大多數(shù)國(guó)家，C亞型病毒目前在北美洲、法國(guó)、中國(guó)和韓國(guó)被報(bào)道，而D亞型病毒目前只在法國(guó)被報(bào)道[10-11]。在A、B、C、D 4個(gè)亞型的遺傳進(jìn)化樹(shù)上，A、B、D 3個(gè)型在一個(gè)分支上，C亞型單獨(dú)在一個(gè)分支上。在4個(gè)亞型aMPV與hMPV的遺傳進(jìn)化樹(shù)上，C亞型與hMPV在一個(gè)分支上。

1.3aMPV對(duì)禽的致病性

1.3.1 aMPV對(duì)火雞的致病性

aMPV引起火雞嚴(yán)重的呼吸道感染，其臨床特征為：打噴嚏，氣管啰音，眶下鼻竇腫脹，鼻塞，泡沫性結(jié)膜炎，眼分泌物增多。鼻分泌物可能由于繼發(fā)性細(xì)菌感染而變得更多、更黏稠，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)咳嗽和神經(jīng)性癥狀的現(xiàn)象[12]。與其他家禽呼吸道感染一樣，如果飼養(yǎng)條件差或繼發(fā)性細(xì)菌感染，可能會(huì)延長(zhǎng)氣囊炎、心包炎、肺炎和肝炎周期的時(shí)間，從而增加發(fā)病率和死亡率。臨床調(diào)查表明，aMPV可增強(qiáng)禽鼻氣管炎鳥(niǎo)桿菌的感染[13]。

在產(chǎn)蛋火雞中，aMPV感染導(dǎo)致產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋殼質(zhì)量下降。感染火雞恢復(fù)可能需要3周的時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi)，火雞多產(chǎn)薄殼蛋，蛋殼質(zhì)量變差，也有產(chǎn)蛋火雞感染后發(fā)生腹膜炎的報(bào)道。目前尚不清楚輸卵管組織是否確實(shí)易受aMPV感染的影響，或者對(duì)生殖道的影響是否源于系統(tǒng)效應(yīng)。

1.3.2 aMPV對(duì)雞的致病性

aMPV可感染雞，并誘導(dǎo)特異性抗體應(yīng)答[14]。當(dāng)雞腫頭綜合征（SHS）第一次在雞群中報(bào)道時(shí)，火雞感染aMPV也出現(xiàn)了同樣癥狀，因此人們認(rèn)為aMPV是引發(fā)SHS的主要誘因，但出現(xiàn)SHS并不總是與aMPV有關(guān)[15]。雞的繼發(fā)性細(xì)菌感染如大腸桿菌病和傳染性法氏囊病的免疫抑制作用在典型的SHS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。SHS疾病特征包括眶內(nèi)和眶周鼻竇炎、鼻分泌物、結(jié)膜炎、斜頸以及臉和下眶竇的腫脹。雖然死亡率很少超過(guò)2%，但是發(fā)病率可能達(dá)到100%，而且在種雞群中，蛋的質(zhì)量會(huì)受到影響[16-17]。SHS在肉雞和種雞群中都有報(bào)道，但雞群出現(xiàn)SHS癥狀，aMPV并不是唯一的病原。例如，在第一例來(lái)自南非的SHS報(bào)告中，同樣分離出傳染性支氣管炎（IBV）病毒[18]。從美國(guó)加利福尼亞州的SHS病例中分離到IBV和大腸埃希菌。在一項(xiàng)研究中，大腸桿菌也能造成雞群的腫頭癥狀。在肉雞中，aMPV可能不是一種主要病原體，或許與另一種呼吸道疾病復(fù)合物中的其他病原體有關(guān)。

2 疑似樣品的采集與處理

在實(shí)際生產(chǎn)中，可嘗試從鼻甲、鼻竇或氣管組織或其拭子中分離病毒[19]。有研究顯示，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)接種雞的全部組織和器官的檢查，證實(shí)了利用肺和非呼吸道組織進(jìn)行病毒分離的效果并不好。有研究發(fā)現(xiàn)，從接種強(qiáng)毒的試驗(yàn)雞的鼻、口腔和咽拭子中均可分離出aMPV，從感染雞的鼻、口腔和咽拭子分離病毒同樣可行也并無(wú)差別。大部分的aMPV在感染火雞和雞的鼻腔組織或氣管中進(jìn)行復(fù)制增殖，在肺和氣囊中發(fā)現(xiàn)的病毒數(shù)量較少[20]。

采集疑似樣品組織之后，應(yīng)立即處理病料。將樣品與PBS 1：5稀釋之后進(jìn)行組織研磨，再加入雙抗防止細(xì)菌污染，并保存于-80℃超低溫冰箱備用。分離毒株或提取RNA時(shí)需進(jìn)行離心取上清進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)，但該方法不適合長(zhǎng)距離多樣品的采集；有報(bào)道用直接印模涂片法或組織勻漿上清液接種FTA卡法采集感染aMPV雛雞的鼻甲、氣管和肺組織，RT-PCR均呈陽(yáng)性。該研究還表明A、B兩種亞型aMPV病毒接種FTA卡在4～6℃下可以保存60 d，仍可進(jìn)行分子鑒定。FTA卡為aMPV陽(yáng)性樣品的采集和運(yùn)輸提供了一種簡(jiǎn)單易行的方法，為分子流行病調(diào)查提供了可靠、無(wú)危害的RNA來(lái)源[21]。

3 aMPV病毒的分離鑒定

在臨床上，aMPV的分離非常困難。因?yàn)椴《驹诟腥厩莺螅湓谇蒹w組織內(nèi)或者排泄物中存在的時(shí)間很短，這使得在實(shí)際臨床中很難確定感染的起始時(shí)間和取樣時(shí)間，其次在病毒感染第4天之后通過(guò)RT-PCR和病毒分離鑒定病毒更困難。病毒分離的材料最好是在臨床癥狀出現(xiàn)之前采取，或者至少在懷疑感染的第一時(shí)刻，這在實(shí)際生產(chǎn)中是很難做到的[22]。更重要的一點(diǎn)是，從田間樣本中分離aMPV并不容易，由于某些原因從雞體內(nèi)分離病毒似乎比從火雞中分離病毒更困難。

3.1 氣管環(huán)分離培養(yǎng)

禽胚氣管環(huán)組織培養(yǎng)（TOC）即禽類的氣管環(huán)，常用于禽類病毒如傳染性支氣管炎病毒、偏肺病毒等的分離、培養(yǎng)等研究。TOC首選為17～20日齡的SPF雞胚或火雞胚（8～10日齡）的氣管環(huán)，也可用無(wú)aMPV抗體的1～2日齡的雛雞制作氣管環(huán)培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)物可以維持?jǐn)?shù)周，接種病毒樣品之后通過(guò)觀察纖毛運(yùn)動(dòng)的停滯來(lái)判斷病毒是否增殖。一般在aMPV感染1周后纖毛活動(dòng)停滯，之后還要繼續(xù)培養(yǎng)幾代。一般使用TOC盲傳3～4代之后可以讓培養(yǎng)上清液適應(yīng)Vero細(xì)胞，再盲傳3～4代，可以看到細(xì)胞病變（CPE）或者通過(guò)間免檢測(cè)到病原。一些早期分離到的A亞型和B亞型的aMPV都是通過(guò)這種方法得到的。

3.2 雞胚的分離培養(yǎng)

很多病毒可以適應(yīng)禽胚，利用禽胚增殖病毒，或者開(kāi)展對(duì)病毒特性的研究。對(duì)偏肺病毒，常用6～8日齡SPF雞胚，并經(jīng)卵黃囊接種培養(yǎng)5～8 d后，無(wú)菌被收集其尿囊液和卵黃囊膜之后進(jìn)行傳代。經(jīng)過(guò)2～3代的盲傳后，如果看到出血胚胎和一些禽胚的死亡發(fā)生，立即將雞胚培養(yǎng)物如尿囊液接種細(xì)胞培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。一旦病毒在SPF雞胚上成功進(jìn)行病毒培養(yǎng)，該病毒就可以很容易地適應(yīng)在各種細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)，例如雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、雞胚肝細(xì)胞（CEL）、哺乳動(dòng)物Vero細(xì)胞株等，從而為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。