富T-DNA-納米氧化石墨烯熒光探針檢測乳制品中的三聚氰胺

常晨陽，單 嬌，常 凱，劉立波，朱秀煥，劉 偉，張為黨

（1.聊城檢驗檢疫局，山東 聊城 252000；2.黃島檢驗檢疫局，山東 青島 266500；3.董家口港檢驗檢疫局，山東 青島 266400；4.唐縣農業(yè)局，河北 唐縣 072350）

三聚氰胺（Melamine），C3H6N6，俗稱密胺、蛋白精，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，具有生物毒性，食用三聚氰胺能誘發(fā)腎衰竭并導致死亡，是一種禁止用于食品及動物飼料中的化學物質[1-2]。由于三聚氰胺中含氮量高達66%，多出蛋白質氨基酸中氮含量300%～400%，摻雜添加三聚氰胺可虛假提高蛋白質含量，被非法添加曾引起過較大的社會負面效應[3-5]。對食品尤其是乳制品中三聚氰胺的監(jiān)控事關人民生命及政府形象和執(zhí)法公信力，技術檢測部門非常重視三聚氰胺的檢測工作。

中國已就乳制品制定了多個三聚氰胺檢測國家及行業(yè)標準，最常用的方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜串聯質譜法[6-9]。高效液相色譜串聯紫外或二極管陣列檢測器（DAD檢測器）可直接檢測三聚氰胺，而氣質聯用法需要對三聚氰胺進行衍生化處理，增加處理過程[10]。液相色譜質譜聯用儀具有高的檢測靈敏度，在部分實驗室作為確定陽性定量使用，但因儀器昂貴，也限制了某些檢測平臺的廣泛使用[11-12]。近年來，用于三聚氰胺檢測的納米探針不斷被報道，但多數研究限于檢測簡單水相，尚未實現在食品安全檢測領域的技術突破。尋找高靈敏度、高選擇性、適合快速現場篩選、開發(fā)新的檢測方法和新平臺一直是三聚氰胺檢測研究的持續(xù)熱點[13-15]。

氧化石墨烯（GO）作為一種新型的納米材料，由于其獨特的物理化學和光學性質，近年來在生物傳感方面的應用越來越廣泛[16-19]。本研究設計了通過可特異性識別三聚氰胺的富胸腺嘧啶的DNA堿基序列，標記熒光素作為信號基團，根據在有無三聚氰胺分子作用后的不同，在有三聚氰胺分子存在時將形成折疊的雙鏈DNA結構，沒有結合三聚氰胺分子保持單鏈狀態(tài)；再通過與單雙鏈DNA作用力明顯不同且對熒光素有高猝滅性能的氧化石墨烯后組裝，形成不同的熒光信號，且信號大小與三聚氰胺的存在量呈正相關，從而實現對三聚氰胺的定量檢測[20-23]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：氧化石墨烯（批號：7782-42-5；純度：99.6wt%）購自南京先豐納米材料科技有限公司；5'端標記熒光染料（FAM）標記的富胸腺嘧啶DNA鏈T-ssDNA-FAM由上海生物工程公司合成并經過HPLC純化，序列為5'-FAM-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTTT-3'；三聚氰胺標準品購自德國Dr公司；試驗所用水均為Mill-Q二次超純水。

儀器：pH-3C型酸度計，FLS-980型熒光分光光度計，高速離心機，電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 氧化石墨烯用量的優(yōu)化

使用氧化石墨烯水溶液初始濃度為1 mg·mL-1。改變氧化石墨烯（GO）的使用濃度：0、2、3、4、5、6、8、10μg·mL-1分別與50 nM的T-ssDNA-FAM混合37℃水浴孵育30 min后測熒光強度的猝滅程度。檢測5'端標記熒光染料（FAM）設定參數為激發(fā)波長為490 nm，掃描范圍為500～600 nm，檢測發(fā)射波長為519 nm，狹縫寬為2 nm。

1.2.2 DNA鏈特異性識別溶液中的三聚氰胺

在緩沖溶液（Tris 20 mM，NaCl 100 mM，KCl 5 mM，MgCl21 mM）中，以終濃度為100 nm富T-ssDNA-FAM探針，加入待檢測三聚氰胺的溶液中，37℃水浴下，孵育30 min，反應體系為500μL。

1.2.3 氧化石墨烯-DNA納米探針

取1 mg·mL-1氧化石墨烯儲備液5μL，加入到反應體系中，用磷酸緩沖溶液定容至1 000μL反應體系，此時為50 nM濃度的熒光標記的富T-ssDNA-FAM，后組裝5μg·mL-1的氧化石墨構成的納米熒光探針，加入石墨烯后繼續(xù)水浴中孵育30 min后，通過熒光分光光度計檢測熒光信號即可完成對三聚氰胺的檢測。

1.2.4 納米探針的熒光恢復曲線

利用以上優(yōu)化好的數據，在1 mL體系中，以50 nM的富T-dsDNA-FAM，后組裝5μg·mL-1氧化石墨烯納米探針，檢測0～3 000 nM不同濃度的三聚氰胺，在37℃下孵育30 min后的響應熒光信號，繪制探針檢測三聚氰胺的熒光恢復曲線。

1.2.5 納米探針的特異性試驗

納米探針（5μg·mL-1）與10 mM葡萄糖、麥芽糖、果糖、賴氨酸、酪氨酸分別在37℃下孵育30 min后測其熒光強度，與500 nM三聚氰胺的響應值做柱狀圖對比。

1.2.6 對乳制品樣品進行應用分析

預處理步驟如下：取液態(tài)乳品1 mL（或粉狀樣品1 g）與高純水8 mL溶于10 mL離心管中，然后加入1.0 mL 1%三氯乙酸（m·m-1），超聲處理10 min后，1 2000 r·min-1離心5 min，上清液用二次水稀釋到10 mL后用1 M的Na2CO3溶液中和至pH為7，進行檢測。

2 結果與討論

2.1 氧化石墨烯用量的優(yōu)化

氧化石墨烯的使用濃度：0、2、3、4、5、6、8、10μg·mL-1分別與富T-ssDNA-FAM 50 nM混合反應后的熒光猝滅曲線見圖1。FAM的熒光強度隨著氧化石墨烯濃度的增加而降低，當氧化石墨烯的濃度為5μg·mL-1時，便可以將溶液中FAM的熒光基本全部猝滅，所以選擇GO濃度為5μg·mL-1進行以下試驗。

圖1 加入不同GO濃度對應熒光的猝滅程度

2.2 熒光表征

驗證基于氧化石墨烯檢測平臺的傳感器的原理，見圖2。圖中曲線c為5μg·mL-1氧化石墨烯溶液的熒光強度值；圖中曲線a表示和富T-DNA序列探針50、500 nM三聚氰胺、后組裝5μg·mL-1氧化石墨烯在20 mM Tris緩沖溶液中測量的熒光強度，此時由于剛性DNA雙鏈結構已形成，氧化石墨烯不會猝滅掉形成雙鏈的富T-dsDNAFAM，所以檢測到游離的FAM的熒光信號；曲線b為沒有三聚氰胺存在下，在上述同樣的緩沖溶液中加入5μg·mL-1氧化石墨烯和50 nM富T-ssDNA-FAM檢測到的熒光信號，此時，由于不能形成折疊結構，富T-ssDNA以單鏈形式存在，導致其5'端標記的FAM熒光基團在氧化石墨烯上被吸附，熒光信號被猝滅。

圖2 三種不同溶液的熒光曲線

2.3 探針響應動力學

為確定三聚氰胺與ssDNA-FAM形成T-三聚氰胺-T結合的雙鏈結構的最佳時間，將500 nM的三聚氰胺后，分別加入50 nM的ssDNA-FAM混合37℃下反應0、5、10、15、20、30 min后，加入5μg·mL-1的GO，測其在 37℃下孵育30 min后檢測的熒光強度的變化見圖3。可見，三聚氰胺與富T-ssDNA-FAM混合雜交10 min就能大部分形成折疊的雙鏈結構，檢測到相應的熒光信號強度。當雜交反應的時間20～30 min后，熒光強度基本不再發(fā)生變化，最終使得富T-ssDNA-FAM探針最大程度的特異性識別三聚氰胺目標分子，選擇30 min作為第一步中形成T-三聚氰胺-T結構的最佳反應時間。

圖3 T-三聚氰胺-T結構形成時間的優(yōu)化

2.4 探針的檢測性能分析

為確定該后組裝納米探針對靶標的熒光信號檢測情況，配制不同三聚氰胺濃度的溶液中加入熒光探針，觀察熒光強度變化情況，見圖4。隨著三聚氰胺濃度的增加，熒光信號逐漸增大，到最后能達到未加入氧化石墨烯猝滅前體系的熒光強度的80%，即相當于標記FAM的DNA絕大多數形成了折疊結構全部游離在溶液中狀態(tài)。三聚氰胺在體系中的終濃度分別為0、10、30、50、100、300、600、800、1 000、1 200、1 500、1 800、2 000、2 300 nM。

圖4 不同濃度三聚氰胺對應的熒光曲線

2.5 傳感器的特異性評價

評價設計的納米探針檢測的特異性，研究了牛奶制品中常見干擾葡萄糖、麥芽糖、果糖及與三聚氰胺有結構相似的賴氨酸、酪氨酸分子對目標物的干擾。試驗證明，納米探針能與低濃度的三聚氰胺特異性結合產生較大的熒光恢復，而對高出幾十倍濃度（10 mM）的葡萄糖、麥芽糖、果糖、賴氨酸、酪氨酸熒光響應極小，說明納米探針的富T序列對三聚氰胺具有很好的選擇性，該探針檢測三聚氰胺的特異性良好，見圖5。

圖5 探針的特異性實驗

2.6 實際樣品的檢測

乳制品基質相對于水相體系，主要是去除蛋白質類雜質對三聚氰胺檢測的干擾，因此選用1%的三氯乙酸對樣品進行簡單預處理，以沉淀乳制品中的蛋白質。通過在不同種類市售乳制品添加500 nM濃度的三聚氰胺進行檢測加標回收，結果見附表。經預處理后的乳制品上機檢測后，可見加標樣品的回收率為76%～119%，且重現性良好。該探針對奶粉中三聚氰胺的檢測下限可達10 nM，遠低于我國規(guī)定的乳制品中三聚氰胺含量≤1 mg·kg-1的要求，可應用于實際乳制品中三聚氰胺的檢測，具有實際應用價值。

附表 樣品的回收率測定結果

3 結論

本研究利用堿基胸腺嘧啶（T）與三聚氰胺（Melamine）的特異性結合的原理，設計了一種由熒光標記的富T-DNA分子與氧化石墨烯后組裝的納米熒光探針。利用氧化石墨烯對單雙鏈DNA作用力的差異，造成的標記熒光染料的猝滅程度的不同，實現對三聚氰胺的特異性檢測。該探針的設計合成簡單、檢測快速、成本低且有較高的靈敏度，線性響應濃度范圍50～1 000 nM，并且可成功用于牛奶、乳飲料、奶粉等乳制品中三聚氰胺的檢測，在食品安全領域將有廣闊的應用前景。本方法省時省力，無需使用大型的昂貴的儀器，為三聚氰胺的檢測提供一種便捷實用的方法。