黃花菜組織培養研究進展

韓志平，張海霞，王麗君，張 琨

（1.山西大同大學生命科學學院，山西大同037009；2.山西大同大學設施農業技術研發中心，山西大同037009；3.山西大同大學，山西大同037009）

黃花菜（Hemerocallis citrina Bar.）屬百合科萱草屬多年生草本植物，是我國的特色蔬菜，其不僅營養豐富、味道鮮美，還具有藥用、觀賞和水土保持等方面的價值，在國內外廣泛栽培[1]。甘肅慶陽、陜西大荔、山西大同、湖南祁東、江蘇宿遷、浙江縉云是我國黃花菜六大主產區[2]。各地農藝工作者為了促進黃花菜產業的發展，對其栽培模式和技術進行了廣泛探索，并取得了一定的成效[3-8]。但是，黃花菜種苗的生產目前仍采用分株、芽塊、切片等傳統繁殖方法，不僅繁殖系數低、速度慢、周期長，還容易造成品種退化，難以滿足種苗大規模生產的需求，限制了黃花菜產業的快速發展[9-10]。

植物組織培養技術能在無菌條件下將離體的植物器官、組織、細胞等，在人工配制的培養基上，經過脫分化和再分化形成完整的植株[11-12]。與傳統的繁殖方式相比，植物組織培養技術不僅能極大地縮短種苗的生產周期，大幅度增加繁殖系數，還能保持母本的優良性狀，降低發生變異的概率，有利于實現種苗的快速繁殖、品種提純，甚至工廠化生產[13-14]。國內早在20 世紀80 年代初就開始研究黃花菜的組織培養技術[15-17]，但至今仍沒有建立起成熟的黃花菜組培體系，國外相關報道也很少[18-19]。

筆者從組織培養育苗過程、外植體選擇和滅菌、培養基配方和激素對黃花菜組培效果的影響、試管苗移栽、組培常見問題等方面，綜述了黃花菜組織培養的相關研究，旨在為黃花菜組培體系的建立及其在黃花菜生產中的應用提供參考。

1 黃花菜組織培養育苗過程

1.1 洗配

洗配包括組培器具準備和清洗、藥品稱量及培養基制備等過程[20]。培養基配制要做到藥品稱量準確，器具潔凈，滅菌徹底。黃花菜組織培養中，MS 和N6 培養基及其1/2 劑量培養基都可以使用，其中，蔗糖2%、瓊脂0.8%，pH 值5.8～6.0。工廠化育苗時可用市售白砂糖代替蔗糖，用罐頭瓶取代三角瓶或組培瓶，生根培養時可用井水代替蒸餾水。

1.2 接種

接種包括外植體準備、愈傷組織誘導、繼代、分化和生根時材料的接種等。各階段材料接種時，關鍵是要做好器具和材料的滅菌消毒，在超凈臺上進行無菌操作，并隨時觀察，避免污染，及時接種轉入下一階段[11]。實際生產中，一個熟練工每天能接種近100 瓶，每瓶接8 個外植體[21]。

1.3 培養

培養指接種后愈傷組織的誘導、繼代、芽的分化和生根培養等過程。各階段培養基和激素的選擇以形成比例高、形態正常、無污染為標準，達到某一階段的標準后及時接種轉入下一階段培養[22]。不同外植體組織培養所經歷的形態變化可能不同，要及時統計和拍照記錄愈傷組織形成、胚狀體、球狀體以及芽、根、苗的形態、顏色、數目、大小等數據。

1.4 移苗

移苗指試管苗長到一定大小時，經過一定時間煉苗移栽到苗床，再經過一定時間的生長轉移到土床進行正常管理的過程。煉苗時要注意方法和時間，移苗的苗床可以蛭石或河沙為基質，同時注意控制苗床濕度，防止試管苗腐爛死亡[23]。

2 黃花菜組織培養中外植體的選擇和滅菌

2.1 外植體的選擇

選擇適宜的外植體是植物組織培養成功的關鍵之一。母株的生長狀態、年齡、基因型及外植體的取材部位和時間都會影響組織培養的形態發生[24]。黃花菜的幼嫩根尖、莖段、葉片、花薹、花柄、花瓣和種子等均可作為外植體，其中以莖、葉較為常用。但是不同外植體的內部生理狀態不同，誘導愈傷組織的頻率、再生試管苗的難易和頻率均存在明顯差異，不同研究者的結果也不完全一致[21，25-26]。

蘇承剛等[27]以根狀莖為外植體進行組織培養，再生的幼苗長勢強，但只有取春季剛長出的幼嫩根狀莖才易培養。王鳳翱等[28]研究發現，幼葉、花薹、花柄、花絲等均能誘導產生愈傷組織，個別材料產生了不定芽、不定根，但以花薹、花柄誘導愈傷組織的頻率高。還有一些研究表明，在同種培養基上，花薹的出愈率最高，其次是花蕾、心葉，花絲、花被筒的出愈率最低[29-30]。還有研究發現，花柄的出愈率較花莖、葉片高，但花柄的出愈率與花期及花蕾大小有密切關系，且花柄的遺傳穩定性較差，少數再生苗形態異常，不宜用作黃花菜組培外植體[25]。唐世建等[21]報道，花瓣再生效果明顯優于心葉、花柄，花薹的誘導率最低；花瓣的誘導效果是越靠近基部越好，多層優于單層，內層優于外層；花柄的誘導效果是兩端好、中間差；心葉的誘導效果與花瓣相似，也是越幼嫩效果越好，多層比單層好，里層比外層好。但是花器官只能在開花期取材，莖尖和葉片作外植體的取材時間較長、樣品也較充足、產生的試管苗健壯易活，較為實用[31]。

2.2 外植體的滅菌

無菌體系的建立是組織培養成功的另一個關鍵環節，其中，外植體的滅菌消毒又是重中之重，直接影響組織培養能否順利進行[24]。滅菌標準是既要徹底殺死外植體表面的微生物，又要盡可能減輕對外植體組織和細胞的傷害[32]。與其他植物相似，黃花菜組培外植體常用酒精、升汞、漂白粉等滅菌：一般先用70%酒精浸泡0.5～1.0 min，再用無菌水沖洗3～5 次；浸入0.1%升汞中10～15 min，之后用無菌水沖洗4～5 次；最后用無菌濾紙吸干，將外植體切成0.5 cm 長待用[14，31]。也可以將材料洗凈并吸干水分后，用75%酒精浸泡30 s；再用飽和漂白粉溶液消毒12～15 min；而后用無菌水淋洗4～5 次；最后分割接種[17]。還可以先用洗衣粉漂洗干凈；再用1%新潔爾滅浸泡15 min，或用0.1%升汞消毒8 min，或用10%次氯酸鈉消毒20 min，用無菌水沖洗3～4 次；最后接種[29]。有研究表明，單獨使用升汞滅菌優于單獨使用酒精、新潔爾滅或漂白粉，酒精與升汞配合滅菌效果更好[30]。

3 黃花菜組培試管苗的形成途徑

黃花菜組培試管苗的形成主要有4 種途徑[14]：一是器官型，即直接從外植體的基部長出試管苗；二是器官發生型，即外植體先誘導產生愈傷組織，再分化形成試管苗；三是胚狀體型，即外植體先誘導產生不定芽，再形成胚狀體，最后分化形成胚狀體苗；四是球狀體型，即外植體先誘導產生愈傷組織，再形成球狀體，最后分化形成苗。其中，球狀體型途徑出苗數量多、質量好、繁殖速度快，可作為工廠化育苗的一個有效途徑[28]。

外植體種類在一定程度上決定著試管苗的形成途徑。花薹、花蕾較易發生愈傷組織或不定芽，幼葉只能誘導出愈傷組織[29]。研究發現，激素水平相同時，幼葉與花藥試管苗的形成途徑完全不同[15]。幼葉形成試管苗的途徑是器官發生型，花藥形成試管苗的途徑是胚狀體型，花柄形成試管苗的途徑既可能是胚狀體型，也可能是球狀體型[25，33]。韓志平等[34]研究表明，黃花菜種子胚芽端組織培養可誘導形成不定芽或愈傷組織，不定芽繼續培養直接抽葉生根形成試管苗。

4 培養基和激素對黃花菜組培效果的影響

4.1 基本培養基對黃花菜組培效果的影響

對于器官發生型和球狀體型2 種途徑，MS 與N6 培養基對誘導愈傷組織無明顯差別[21]，多數研究者使用MS 培養基。有研究表明，用MS 培養基可以誘導出胚狀體[35]。但也有學者發現，激素相同時，MS培養基不能誘導胚狀體，N6 培養基則能誘導形成大量胚狀體，認為N6 培養基更適合誘導胚狀體[33]。研究結果的差異可能與外植體、取材時間、試驗條件不同有關。多數試驗選用1/2 MS 培養基進行生根培養[31]。但也有研究發現，在不加激素的MS 培養基上，組培苗生根率可達95%以上，更適合進行生根培養[27]。

此外，水解酪蛋白對誘導黃花菜外植體愈傷組織有明顯效果，在培養基中添加水解酪蛋白成分可使得花蕾、花薹切段發生愈傷組織，不定芽或胚狀體的誘導頻率明顯提高[29]。董雅茹等[23]研究表明，固體培養基生根率高，但根和地上部長勢不如液體培養基。液體培養基根系發達、根毛多，植株健壯，葉色深綠，移栽成活率高，同時液體培養基配制簡便、成本低，用于生根培養更好。

4.2 激素種類和配比對黃花菜組培效果的影響

在不同的培養階段，根據外植體類型和培養目的，激素種類和配比對黃花菜組培結果影響很大[36]。在愈傷組織誘導階段，根狀莖在MS＋2，4-D 0.5～1.0 mg/L＋6-BA 0.1～0.5 mg/L 培養基上，出愈率可達90%以上[27]。以心葉為外植體時，MS＋2，4-D4 mg/L的出愈率最高；花薹、花絲、花被筒為外植體時，MS＋2，4-D 2 mg/L 的出愈率最高[30]。唐世建等[21]則報道，MS＋2，4-D 2.0～2.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L 誘導心葉、花瓣、花柄、花薹形成愈傷組織的效果最好，愈傷組織數量多、質地較松散。還有學者發現，花柄切段接種在添加NAA 0.05 ～0.20 mg/kg＋6-BA 2 mg/kg、NAA 0.2 mg/kg＋KT 2 mg/kg 或KT 1 mg/kg＋2，4-D 0.5 mg/kg 的MS 培養基上，均能誘導形成愈傷組織[37]。實際操作時，應根據外植體種類，選擇適宜的培養基和激素種類及其配比，從而提高愈傷組織誘導率。

繼代培養階段，培養基中激素配比又有不同。根狀莖愈傷組織在MS 培養基上添加6-BA 1 mg/L＋NAA 0.01 mg/L 分化芽最好，芽分化率可達100%[27]。但也有研究表明，莖尖愈傷組織在MS＋6-BA4mg/L＋NAA 0.1 mg/L 上繼代培養最好[31]。還有學者報道，以MS＋6-BA 1 mg/L＋NAA 0.1 mg/L 進行花薹、花絲、花被筒愈傷組織的芽分化效果最好[30]。唐世建等[21]研究則發現，在心葉、花薹、花瓣、花柄愈傷組織繼代培養中，2，4-D 用量越大，愈傷組織越緊密，6-BA 用量越大，愈傷組織越易分化，MS＋2，4-D 2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L 為最優組合。

黃花菜組培苗常用1/2 MS 培養基添加NAA 0.2 mg/L 或IBA 0.2 mg/L 誘導生根，但在MS 培養基上，不添加激素生根率可達96%，添加NAA 后生根率明顯降低[27]。也有研究發現，組培苗在不含有激素或只含有生長素的全量或半量MS 或N6 培養基上均能生根，但加入適量的NAA 可促進生根[29]。因此，在選擇激素種類和濃度時，要充分考慮培養目的及基本培養基的影響。

5 黃花菜組織培養試管苗的移栽

黃花菜組培苗長出3～4 片葉、新根長1 cm 左右時要及時移苗。由于組培瓶內外環境差異較大，應先打開瓶塞，在自然溫度下煉苗1～3 d，使小苗開始接觸并逐漸適應外部環境。而后將試管苗從組培瓶中小心取出，洗去根上培養基，用吸水紙或紗布覆蓋根部3～4 d，促使根毛發生，再將苗栽入苗床或營養缽中，可以提高移栽成活率。實驗室移苗一般以蛭石為苗床基質，生產上常用河沙和泥土以體積比3∶1～4∶1 混合成苗床基質[14]。研究表明，未經滅菌的基質中組培苗成活率與滅菌的基質無明顯區別，均可達到90%以上[21]。配制基質的土壤黏性要好，這樣保水性較好，也可使基質表面干燥，以避免移苗后莖基部腐爛，提高組培苗的成活率，而且不需要對苗床基質滅菌，可以節約人力、物力，降低生產成本[38]。

移栽后要控制苗床溫度，保持葉叢濕度。大棚內溫度冬季保持15 ℃以上，夏季保持32 ℃以下，有利于組培苗的正常生長。苗成活后正常澆水施肥。小苗在苗床生長15～20 d 后，可轉移到土床培育，按常規育苗技術管理。生長30 d 后，苗高達15 cm、根長達20 cm 時，即可移栽到田間正常生長。如果白天氣溫高、陽光太強，要選擇午后或陰天移栽，并注意移栽后溫度、濕度、光照等的管理，防止傷苗[17]。

6 黃花菜組織培養常見問題及其解決方法

6.1 污染問題及其解決方法

植物組織培養中經常發生接種后或繼代培養后，材料或培養基污染發霉等問題。污染的原因可能是由于外植體的選擇和滅菌不徹底、培養基或培養器皿消毒不徹底、超凈臺不達標或操作不當、環境不潔凈等[22，39-40]。應特別重視材料和器具的滅菌消毒，對組織培養涉及到的各種設備、器具、培養基、外植體等采用正確、恰當的滅菌消毒方法，全面、徹底進行滅菌消毒，必要時可進行二次滅菌，對培養中發現的已污染材料要及時進行清理[41-43，26，34]。

6.2 組培苗的老化、 褐化和玻璃化問題及其解決方法

組培苗在組培瓶內時間過長，由于培養基有效成分減少，隨著小苗的生長和數量的增加以及空間、光照等的變化，常會出現小苗老化，如葉色變淡、植株枯萎、生長勢衰退等。為此，應適時分離繼代培養，提高組培苗質量[38]。在球狀體培養過程中，一旦球狀體外面幾層細胞出現黃褐色栓質化時，應及時割切轉瓶培養，防止老化[28]。

在植物組織培養中，經常會發現外植體或培養物褐化、枯死，這種情況對外植體的脫分化和再分化有嚴重影響，對某些植物的組織培養起決定性作用[44-47]。影響褐化的因素有外植體的種類和生理狀態、培養基的成分和激素比例、培養條件等[48-49]。通過母株和外植體的預處理[50-51]、選擇適宜的培養基及培養條件[52-53]、培養基中加入防褐劑[54]、連續轉移外植體[55-56]等措施可有效減少褐化發生。

在愈傷組織繼代增殖過程中有時會出現少量玻璃化現象，即葉片或莖段成水漬狀、半透明，葉片皺縮，脆弱易碎[57]。原因可能是由于培養環境濕度過高、溫度較高、光照太弱等原因，造成呼吸和光合性能降低，影響水分、營養和CO2的吸收，從而導致生長不良和玻璃化[58-59]。發現玻璃苗應及時轉瓶，置于適宜的培養環境下，增加光照強度和CO2濃度、降低培養溫度，大部分可轉化成正常苗[10，60]。

6.3 組培苗移栽的成活率問題及其解決方法

組培苗移栽是組織培養的最后階段，其成活率的高低是關系到組培成敗的關鍵問題。黃花菜組培苗生根后移栽成活率較低，主要是組培苗根系缺乏根毛，在外界自然環境下難以吸收水分和養分[28]。移栽成活率還與試管苗健壯程度、煉苗方法及時間、苗床基質、移栽后的管理等有關[61]。因此，移苗前煉苗時必須設法促使根毛發生，以提高移栽成活率。移栽基質要注意保水、保肥和通氣性。研究發現，球狀體苗相對健壯，容易成活，在組培過程中應盡可能誘導球狀體苗。移苗要及時，移栽過遲，小苗在瓶內彎曲生長，使根與莖的極性受到影響，會出現根與苗同向生長，給移栽造成困難。成活率高低還與移栽時期有關[62]。春末夏初氣溫適宜、濕度較高，苗更易成活；冬季氣溫太低、仲夏氣溫過高、濕度低都不利于苗的成活和生長，若移苗需加強保溫、保濕，防止高溫和強光。

7 黃花菜組織培養的前景

黃花菜組織培養中存在愈傷組織誘導困難、組培苗發生途徑多樣、白化苗和污染較常見、組培苗移栽后成活率較低等問題。因此，目前黃花菜組織培養技術尚不成熟，加上其技術要求高、育苗成本大，至今沒有在生產上推廣應用。但黃花菜組織培養具有2 個明顯的優點：一是取材方便，不影響生產。不同部位的幼嫩組織均能形成試管苗，取材局限性小。而且由于是多年生宿根植物，再生能力強，可重復取材，對田間生產幾乎沒有影響。二是繁殖系數高，速度快。外植體接種后誘導愈傷組織約需10～15 d，有的愈傷組織再經7 d 在原培養基上分化出苗，有的轉移到分化培養基上經15～20 d 分化出苗。有的外植體直接產生不定芽以及胚狀體，轉移到光照條件下培養10～20 d 長成小苗。試管苗分離培養后又可以多種途徑再次繁殖，且試管苗在組培瓶中生長很快，能在短時間內獲得大量植株，繁殖系數在60 d 內可達到100 倍以上[38]。

因此，相關研究人員需要從組織培養的各個環節深入研究黃花菜組織培養體系，包括適宜的外植體及其滅菌方法、愈傷組織誘導、不定芽發生、繼代、抽葉、生根等階段培養基和激素配比，以及組培苗的促生根毛方法、玻璃化和白化苗的轉變等。只有解決好這些問題才能夠建立起成熟完善的黃花菜組織培養體系，為黃花菜的工廠化育苗及其在生產上的應用奠定堅實的基礎，從而推動黃花菜產業的快速發展，為各產區農業結構調整和供給側改革作出貢獻。