飼用植酸酶活性測定關(guān)鍵控制點(diǎn)

于洪蓮

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和飼料生產(chǎn)水平的提高，植酸酶作為一種綠色環(huán)保型添加劑廣泛應(yīng)用于單胃動物飼料中，其通過催化將飼料原料中豐富的植酸及植酸鹽分解為能被動物利用的無機(jī)磷和肌醇，可有效提高植物性飼料中磷、礦物質(zhì)元素和蛋白質(zhì)的可利用率，提高動物生產(chǎn)性能，因此植酸酶在飼料生產(chǎn)中可定量取代或減少無機(jī)磷的添加量，在降低畜禽養(yǎng)殖成本的同時還減少了動物糞便中磷的排放量，減輕磷對環(huán)境污染。植酸酶的研究對解決環(huán)境污染和滿足營養(yǎng)需求方面有著重要意義。

飼用酶制劑活性分析與檢測在飼料工業(yè)中具有重要的作用，酶制劑生產(chǎn)企業(yè)通過檢測產(chǎn)品酶活力來監(jiān)控產(chǎn)品穩(wěn)定性，保證酶制劑產(chǎn)品品質(zhì)，飼料生產(chǎn)企業(yè)需要通過檢測飼料產(chǎn)品中酶制劑的含量來驗(yàn)證其添加效果（即飼料中酶的活力保存率），以保障飼料品質(zhì)，因此酶活力的測定是控制酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是使用效果的基本保障。如何準(zhǔn)確檢測植酸酶含量是許多飼用酶制劑工作者普遍關(guān)心的問題。本文以國標(biāo)檢測方法為依據(jù)，綜述了植酸酶活力測定方法及檢測中關(guān)鍵控制點(diǎn)，以期為植酸酶的檢測提供可行性參考。

1 植酸酶活性測定的方法及原理

1.1 測定方法

《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》是現(xiàn)行有效的飼用植酸酶活性測定的國標(biāo)方法，即GB/T 18634-2009。本文以國標(biāo)檢測方法為依據(jù)。

1.2 測定原理

依據(jù)國標(biāo)檢測方法，其原理為：植酸酶在一定溫度和pH條件下，將底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能與釩鉬酸銨生成黃色的復(fù)合物，可于波長415 nm下進(jìn)行比色測定[1]。

1.3 植酸酶活性單位

酶活性單位定義為：樣品在37 ℃、pH 5.5 的條件下，每分鐘從濃度為5.0 mmol·L-1植酸鈉溶液中釋放出1 μmol 無機(jī)磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示[1]。

2 植酸酶活性測定的關(guān)鍵控制點(diǎn)

影響植酸酶活性測定的因素很多，如標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、試樣溶液的制備、乙酸緩沖溶液及底物植酸鈉溶液的配制、溫度、pH、反應(yīng)時間、離心速度和時間的控制等，這些在酶促反應(yīng)過程中直接影響反應(yīng)速率。下面具體介紹飼用植酸酶活性測定的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

嚴(yán)格按照實(shí)國標(biāo)方法中規(guī)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，基準(zhǔn)物磷酸二氫鉀需預(yù)先在（105±2）℃電熱干燥箱中干燥至恒重，標(biāo)準(zhǔn)品的稱量要使用感量為0.000 1 g的分析天平。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，否則需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新配試劑或更換化驗(yàn)員都需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 試樣溶液的制備

試樣溶液濃度對酶反應(yīng)的影響：如果其他條件都是適宜的話，在一定范圍內(nèi)隨著試樣溶液的濃度的增加，酶促反應(yīng)速率隨試樣溶液濃度增加而加快，當(dāng)試樣溶液達(dá)到一定濃度時，受底物數(shù)量限制，酶促反應(yīng)速率將不再增加，酶活性的測定結(jié)果就不準(zhǔn)確，因此要從以下幾方面控制試樣溶液濃度。

2.2.1 酶的提取

按國標(biāo)的建議稱樣量稱取植酸酶試樣（包被植酸酶樣品需要研磨處理）兩份，精確至0.000 1 g，置于100 mL 容量瓶中，加入乙酸緩沖溶液搖勻并定容至刻度，放入一個磁力攪拌子，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min。液體樣品無需提取直接稀釋備用。攪拌時間不夠或攪拌速度過低都會使得酶未完全提取引起檢測結(jié)果偏差，而提取過程攪拌速度過快會導(dǎo)致液體飛濺使得酶活檢測不準(zhǔn)確，因此需要保證提取時間及適宜的攪拌速度。注意乙酸緩沖液含有曲拉通和牛血清白蛋白（BSA）成分，在轉(zhuǎn)移或振蕩過程中會產(chǎn)生較多的泡沫，所以在稀釋過程中應(yīng)盡量避免因泡沫的體積誤差造成稀釋倍數(shù)低，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。

2.2.2 試樣溶液稀釋

稀釋倍數(shù)的確定主要依據(jù)主要產(chǎn)品推薦酶活性或標(biāo)示量、稱樣量和國標(biāo)方法中要求的試樣溶液濃度確定的。國標(biāo)方法中規(guī)定最終試樣溶液濃度應(yīng)保持在約0.4 U·mL-1，試樣溶液稀釋倍數(shù)計(jì)算公式為：試樣溶液稀釋倍數(shù)=估計(jì)酶活力×稱樣量/0.4。如：植酸酶估計(jì)酶活力為5 000 U·g-1，稱樣量為1.0 g，其稀釋倍數(shù)=5 000×1.0/0.4=12 500。試樣酶在提取時已稀釋100倍，提取后的試樣在離心機(jī)上以4 000 r·min-1離心10 min，分取不同體積的上清液用緩沖溶液進(jìn)行逐步進(jìn)行稀釋至12 500倍，移液過程要求準(zhǔn)確無誤，渦旋混合均勻。

2.3 乙酸緩沖溶液配制

乙酸緩沖溶液是確保整個酶促反應(yīng)體系pH 的關(guān)鍵因素，需要準(zhǔn)確配制后調(diào)節(jié)pH 為5.50。調(diào)節(jié)配制溶液pH 使用的酸度計(jì)必須校準(zhǔn)，所用復(fù)合電極必須在使用壽命內(nèi)。盡管乙酸緩沖溶液在密閉的容器內(nèi)室溫下可存放2個月有效，但存放期＞1個月，建議重新確認(rèn)pH，如果有變化，需要重新調(diào)節(jié)pH。

2.4 底物植酸鈉溶液的配制

2.4.1 底物植酸鈉的型號選擇

植酸鈉是影響植酸酶活性測定結(jié)果的重要因素，李富偉等研究顯示，不同型號的植酸鈉對測定結(jié)果的影響是顯著的[2]。因此在酶活性測定中需遵照《飼用植酸酶活性測定分光光度法》（GB/T18634-2009）中規(guī)定植酸鈉（相對分子質(zhì)量為923.8、純度為95%）來選擇底物。在測定過程中，如果更換底物的生產(chǎn)廠家、型號及批次，必須對新的植酸鈉底物進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)校正，選擇適宜的植酸鈉底物以便得到正確和統(tǒng)一的酶活性測定結(jié)果，這樣才有利于確定植酸酶作為飼料添加劑時的準(zhǔn)確添加量。

2.4.2 底物溶液濃度

底物濃度是植酸酶活性測定的關(guān)鍵要素。閔兆升等研究表明，底物濃度較低時不能使植酸酶完全催化，但高底物濃度對植酸酶的催化活性也有抑制作用[3]。在底物濃度為0～4.8 mmol·L-1時，酶促反應(yīng)速率隨著底物濃度的增加而加快，反應(yīng)速度與底物濃度近乎成正比；底物濃度為4.8～6.6 mmol·L-1時，反應(yīng)速率變化不顯著，維持一個較平穩(wěn)的狀態(tài)；當(dāng)?shù)孜餄舛龋?.6 mmol·L-1時，酶促反應(yīng)速率隨底物濃度的增大而急劇減緩，說明高濃度底物對酶促反應(yīng)存在抑制作用，因此需要依據(jù)國標(biāo)要求控制底物植酸鈉溶液濃度，植酸鈉底物配制濃度為7.5 mmol·L-1，實(shí)際最終反應(yīng)濃度為5 mmol·L-1，保證底物濃度是過量的，使得酶促反應(yīng)充分，得到準(zhǔn)確的植酸酶活性測定結(jié)果。

2.4.3 底物pH

植酸鈉是一種強(qiáng)堿性弱酸鹽，溶解于水后顯堿性。按國標(biāo)要求使用乙酸緩沖液（1）配制的，但用已校準(zhǔn)過的酸度計(jì)檢測配制后溶液的pH 已偏離5.50，實(shí)驗(yàn)室配制完的底物溶液的pH 約為7.50，需用18%的冰乙酸溶液（避免使用低濃度乙酸調(diào)節(jié)pH）單向調(diào)節(jié)pH 至5.50。植酸鈉溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。另注意酸度計(jì)的日常維護(hù)，電極需浸泡在電極保護(hù)液中，測定過酶液、pH過高、pH過低或者黏度很大的樣品后，電極反應(yīng)會變得遲鈍，所以一定要仔細(xì)沖洗電極，必要時電極需要用強(qiáng)酸浸泡清洗，還要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)，才能保證用配制的溶液符合植酸酶活性測定的要求。

2.5 溫度控制

在一定溫度范圍內(nèi)酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而加快，但當(dāng)溫度升高到一定值時，酶促反應(yīng)速度不再加快反而隨著溫度的升高而下降。植酸酶活性測定過程中溫度是非常關(guān)鍵因素，溫度過低或過高都會影響酶促反應(yīng)速率，因此在檢測過程中溫度應(yīng)控制在37 ℃。水浴鍋的溫度要用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)進(jìn)行測量校準(zhǔn)。保證試樣溶液及底物溶液按標(biāo)準(zhǔn)要求預(yù)熱。恒溫水浴鍋內(nèi)水的液面要高于試管內(nèi)反應(yīng)液的液面。為了維持水浴的均衡，有條件的實(shí)驗(yàn)室最好采用循環(huán)水流或振蕩水浴。

2.6 反應(yīng)時間控制

酶活性測定過程中反應(yīng)時間是一個非常重要的因素，要求各反應(yīng)管反應(yīng)時間一致均嚴(yán)格控制在30 min。為了確保獲得精確的測定結(jié)果，在反應(yīng)過程中，從反應(yīng)物混合開始準(zhǔn)確計(jì)時，向每支試管中加入試劑的時間間隔要一致，且時間間隔要充足，預(yù)留出完成下步所需要的時間。

2.7 酶解反應(yīng)終止及顯色液的配制

終止顯色液混合順序，1份鉬酸銨溶液+1份偏釩酸銨溶液，最后加入2份硝酸溶液混合均勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用溫水（50～60 ℃）配制偏釩酸銨溶液，易溶解且穩(wěn)定，配制好的溶液棕色試劑瓶避光保存。

2.8 離心速度和時間的控制

國標(biāo)方法中規(guī)定酶促反應(yīng)中之后，反應(yīng)后的試液需在室溫下靜置10 min，如出現(xiàn)渾濁需在離心機(jī)上以4 000 r·min-1離心10 min。在日常實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)室溫靜置或以3 000 r·min-1離心10 min，會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度不呈梯度。若以5 000 r·min-1離心10 min時，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線各梯度的吸光度要低于以4 000 r·min-1離心10 min，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制空白管和樣品管離心速度和時間為4 000 r·min-1離心10 min。

2.9 紫外分光光度計(jì)測定吸光值

酶促反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)在1 h 內(nèi)離心測定吸光度，取上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)415 nm 波長測定試樣空白和試樣溶液的吸光值。注意試樣溶液與式樣空白必須澄清，不得有渾濁，測定前用待測溶液潤洗比色皿1次，減少誤差。吸光度應(yīng)控制在0.2～0.4，此區(qū)間計(jì)算的結(jié)果誤差較小。在檢測植酸酶樣品時，酶活性的標(biāo)示量與實(shí)際含量可能會差異很大，會導(dǎo)致吸光值或高或低，吸光值未在范圍內(nèi)，需要重新調(diào)整試樣溶液的稀釋倍數(shù)再進(jìn)行檢測。

2.10 檢測結(jié)果的判定

檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定主要可通過以下幾方面進(jìn)行衡量檢驗(yàn)。

2.10.1 測定結(jié)果重復(fù)性

測定結(jié)果重復(fù)性主要是通過平行試樣測定結(jié)果間相對偏差大小來考證。標(biāo)準(zhǔn)要求同一試樣兩個平行測定值的相對偏差應(yīng)≤8%，如超出這個范圍需要重新測定酶活性。

2.10.2 測定結(jié)果的再現(xiàn)性

不同工作日或不同分析人員間測定結(jié)果的分析比較來評價酶活性測定結(jié)果的再現(xiàn)性[4]。

2.10.3 測定結(jié)果的準(zhǔn)確性

實(shí)驗(yàn)室需要在測定時加1個已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗(yàn)整個過程是否偏離。如果檢測中發(fā)現(xiàn)已知酶活檢測結(jié)果未在誤差范圍內(nèi)，應(yīng)查找原因后再安排檢測。在實(shí)驗(yàn)室酶活測定過程中，存在很多隨機(jī)因素，每次實(shí)驗(yàn)測定帶參考樣是一項(xiàng)非常有效的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制措施。

參考樣需兩位實(shí)驗(yàn)員5 次平行實(shí)驗(yàn)檢測獲得，取平均酶活力作為參考標(biāo)準(zhǔn)。對照樣要分裝密封置于-25 ℃急凍保存。

2.11 其他關(guān)鍵因素

2.11.1 要求無磷污染

測定過程中要使用無磷水。清洗實(shí)驗(yàn)器皿要無磷的清洗劑，反應(yīng)離心管清洗后需沸水浴5 min，使用1周后應(yīng)洗液浸泡，避免平行樣偏差較大導(dǎo)致結(jié)果偏低。

2.11.2 對化驗(yàn)員的要求

植酸酶活性的測定要求化驗(yàn)員注重工作細(xì)節(jié)，例如試樣、試劑稱量或配制的精確性，pH 的調(diào)節(jié)的準(zhǔn)確性，移液和計(jì)時的準(zhǔn)確性，分析和解決問題的及時性。

3 小 結(jié)

植酸酶活性的測定在植酸酶產(chǎn)品的質(zhì)量控制、產(chǎn)品標(biāo)簽、酶活力保證及實(shí)際應(yīng)用都有著重要的作用[5]。采用國標(biāo)法測定植酸酶活性時應(yīng)注意以上事項(xiàng)，以在檢測植酸酶活性中獲得準(zhǔn)確和重復(fù)性好的分析結(jié)果。