茶樹莖段組織培養過程中防褐化污染方法研究

吳婉婉，孫威江，陳志丹

1.福建農林大學園藝學院，350002；2.陜西果業集團有限公司漢中獼猴桃研發中心，710000；3.福建農林大學安溪茶學院，350002；4.福建省茶產業工程技術研究中心，350002；5.福建省茶產業行業技術開發基地，350002

植物組織培養自20 世紀初發展到現在，已經成功應用于農業、醫藥業、林業等領域并產生了巨大的經濟、社會效益。污染、褐化和玻璃化[1-2]是植物組織培養中公認的三大難題。茶樹是一類多酚類含量高且自身攜帶內生菌較多的植物，在組培過程中經常會出現外植體褐化、污染等問題。游見明[3]、張婉婷等[4]對茶樹體內內生菌的動態、分布規律等做了一些研究，但關于在茶樹組培過程中出現的內生菌污染的防治還未見相關報道。

本試驗以福鼎大白茶嫩莖為材料，研究探討降低茶樹組織培養過程中外植體褐化和內生菌污染的幾種方法。

一、材料與方法

1.材料與主要試劑、設備

試驗材料：春、秋季生長帶飽滿腋芽的福鼎大白茶莖段。

主要試劑：95%無水乙醇、升汞（氯化汞）等。

儀器設備：電磁爐、自動高壓蒸汽滅菌鍋G154DS（致微廈門儀器有限責任公司）、純水器、超凈工作臺（蘇凈安泰）、接種器具消毒器（上海稼豐園藝用品有限公司）。

2.試驗方法

（1）材料預處理

將所采集的用于腋芽誘導的材料剪去葉片和上、下端較嫩和較老的部分，留中間帶2～3 個腋芽的莖段，將材料置于燒杯中，先用洗衣粉水浸泡3～5 min，清洗掉表面塵土污垢（必要時用軟毛刷輕刷材料表面），倒掉洗衣粉水，在燒杯蒙紗布置于自來水下沖滴1.0～1.5 h，再用蒸餾水沖洗1遍，在燒杯外噴灑酒精后置于超凈工作臺內（超凈工作臺事先進行紫外燈滅菌25 min左右），備用。

（2）外植體不同消毒方式比較試驗

取經預處理的福鼎大白茶莖段于燒杯中，在超凈工作臺上消毒，再用消毒后的手術刀將福鼎大白茶幼嫩莖外植體切成1 cm 左右帶1 個腋芽的莖段，接入培養基中進行培養，每瓶接種10個外植體，設3 次重復，14 d 后統計污染率和褐化率，記錄結果。

（3）不同種類、濃度的吸附劑對福鼎大白茶外植體褐化的影響

通過在培養基中添加不同濃度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭（AC），比較其對福鼎大白茶外植體褐化的控制效果，以不加吸附劑的培養基（CK）為對照。PVP設置100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L 3個質量濃度，AC設置50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L 3個質量濃度，每個處理設3次重復，接種14 d后統計褐化率。

（4）不同種類、濃度的抗生素對福鼎大白茶外植體污染的控制效果

在培養基中分別添加抗生素氨芐青霉素（AMP）和硫酸鏈霉素（L），各設4個不同濃度處理，每個處理重復3 次，以不添加抗生素的培養基（CK）為對照，觀察接種后對外植體內生菌的控制效果。

二、結果與分析

1.不同消毒方式對福鼎大白茶外植體污染率和褐化率的影響

不同消毒方式下福鼎大白茶外植體污染率和褐化率結果見表1。從表中可見，B3 消毒方式能有效控制外植體的污染，但在控制褐化方面不及B1、B2；B1 處理在控制外植體褐化方面效果最好，但在控制污染方面不及B2、B3。綜合污染率、褐化率兩個指標來看，較為理想的外植體消毒方式為B2：75%酒精20～25 s+0.1%升汞4 min+無菌水沖洗2遍+0.1%升汞5 min+無菌水沖洗4遍。

表1 不同消毒方式處理14 d后外植體污染率和褐化率結果

2.不同種類、濃度的吸附劑對福鼎大白茶外植體褐化的影響

在培養基中添加不同種類、濃度的吸附劑，觀察其對福鼎大白茶外植體褐化的影響，結果見表2。從表中可看出，與對照相比，用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或活性炭（AC）處理后，外植體褐化率都低于對照（CK），說明在培養基中添加PVP或AC都能降低外植體的褐化率，但AC對外植體褐化的控制效果優于PVP，最佳的AC質量濃度為150 mg/L。

表2 不同濃度的PVP和AC處理對外植體褐化的控制效果

3.不同濃度的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對內生菌的抑制效果

在培養基中分別添加氨芐青霉素和硫酸鏈霉素，以抑制外植體內生菌，結果（表3）表明，8個處理與對照間都存在顯著性差異，說明在培養基中添加氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對內生菌都有一定的抑制效果，能夠顯著降低茶樹外植體的污染率，且硫酸鏈霉素的使用效果優于氨芐青霉素，最佳的硫酸鏈霉素質量濃度為150 mg/L。

表3 不同濃度的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對外植體污染率的影響

三、結論

外植體滅菌是植物組織培養中的重要環節。外植體滅菌要求做到既要少傷害外植體，又要盡可能地將組織材料表面的細菌、真菌等徹底殺死[5]。茶樹是木本植物，升汞是最佳的外植體消毒劑，但它對材料的毒害性要強于其他消毒劑，因此，在使用時要根據外植體的類型、老嫩程度來選擇最佳的消毒時間和消毒方式。間歇性升汞消毒法對外植體進行消毒時能夠較有效降低外植體的污染率，同時因在2 次升汞消毒之間加了無菌水清洗的過程，從而減輕了一次性升汞消毒對材料的毒害作用。

茶樹是多酚類含量較高的植物，在進行茶樹組培過程中，由于外植體要受到切割，產生傷口，其體內原有的酶-底物的隔離被打破，一些酚類、醌類等有害物質會順著傷口分泌到培養基中，積累到一定的量時，就會引起外植體發生褐化繼而死亡。活性炭具有多孔結構和較強的吸附性，對分泌到培養基中的酚、醌等有一定的吸附作用，以減少它們在培養基中的積累，從而達到防止褐化的目的[6]。

此外，茶樹體內攜帶有較多內生菌，組培過程中內生菌也是引起外植體污染的主要原因之一，但由內生菌引起的污染較難控制，一般的消毒劑對內生菌來說效果甚微。目前，研究人員對于組織培養過程中出現的污染問題，一般采用在培養基中加入殺菌劑[7]、抗生素[8-9]，或者在外植體類型的選擇、滅菌方式等方面采取一些措施來克服此問題。

本試驗結果表明，茶樹外植體采用75%酒精20～25 s +0.1%升汞4 min +無菌水沖洗2 遍+0.1%升汞5 min+無菌水沖洗4遍消毒后，接入含150 mg/L 活性炭和150 mg/L 硫酸鏈霉素的培養基中培養，能較好地控制茶樹組織培養過程中外植體的褐化和污染問題，提高茶樹組織培養成功率。