海洋低溫甾醇酯酶菌株的篩選鑒定及其酶學特性研究

任楠楠，王曉輝，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

甾醇酯酶（EC 3.1.1.13），又稱為膽固醇酯酶，在生物體（如一些高等動物的臟器官、原生動物和微生物）中廣泛存在[1]。作為一種酯類水解酶，甾醇酯酶可催化甾醇酯水解生成甾醇和脂肪酸，同時，在適宜條件下也可通過酯化或酯交換反應催化甾醇酯合成。甾醇酯酶可廣泛應用于食品、醫藥和化工產業等[2]。在食品領域中，植物甾醇作為新資源，是食品研發的熱點，但植物甾醇在食品體系中會出現結晶現象，穩定性也不及甾醇酯，因此考慮用甾醇酯酶將植物甾醇改性轉變成植物甾醇酯，制成功能性食品[3-5]；在醫藥方面，甾醇酯酶可作為工具酶制成試劑盒，測定膽固醇含量，但目前所使用的大多數試劑盒均來自進口，價格昂貴[6]；在化工業中，甾醇酯酶可與脂肪酶聯合使用，解決“樹脂障礙”問題[7-9]。目前，國內外已有關于微生物來源的甾醇酯酶的研究[10-11]，但是鮮見從海洋中篩選產甾醇酯酶的低溫菌株的相關報道，且國內幾乎沒有相關商品化的甾醇酯酶的生產。

本研究擬從海洋環境中選育出一株能夠高產甾醇酯酶的低溫菌株，對該菌株進行系列鑒定，初步探究其產酶特點，為后期海洋低溫甾醇酯酶的實際生產與應用奠定理論基礎[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

試驗菌株篩選自遼寧省大連渤海灣（N：39°7′，S：121°41′）的海泥海水樣品。

1.1.2 培養基

菌株初篩培養基：植物甾醇酯30.0 g/L，聚乙烯醇10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.1 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，用0.22 μm的濾膜對0.1%羅丹明B過濾滅菌，加入培養基中，pH自然。

菌株復篩培養基：植物甾醇酯10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，pH自然。

種子培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

（Luria-Bertani）LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

以上培養基均在0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

植物甾醇酯：江蘇春之谷生物制品有限公司；羅丹明B：國藥集團化學試劑有限公司；膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，COD）：上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，POD）：生工生物（上海）股份工程有限公司；膽固醇亞油酸酯、4-氨基安替吡啉（4-aminoantipyrine，4-AA）：大連凱美化工工程配套有限公司；其他主要試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-40BI壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；HD-1360型超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器有限公司；BA410E生物顯微鏡：麥克迪奧實業集團有限公司；雷磁PHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；HZP-256全溫振蕩培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；Thermo K3型酶標儀：北京昊諾斯科技有限公司；0.22μm一次性針頭濾器：生工生物（上海）股份工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

菌株初篩：稱取10.0 g樣品加入90 mL無菌水中，搖床振蕩30 min后過夜富集培養。用無菌水梯度稀釋富集菌液，取適宜濃度的菌液100μL均勻涂布于菌株初篩培養基上，在恒溫培養箱內28℃倒置培養[12]，觀察培養基中菌株生長情況，挑取陽性菌落進行純化并保存。

菌株復篩：將初篩得到菌株進行搖瓶發酵培養（200 r/min），檢測菌株產甾醇酯酶活性高低，逐步篩選出目的高產菌株[12]，作為本次試驗的出發菌株。

1.3.2 甾醇酯酶活性測定方法

根據甾醇酯酶活性的測定原理[13]進行酶活性測定，具體操作參考曾誠等[14]的報道：分別配制底物溶液（在0.15 mol/L磷酸緩沖液中先后加入膽固醇亞油酸酯0.61 mmol/L，異丙醇8.0%，0.015 Triton X-100 mol/L，調節pH 為7.0）與4-AA-苯酚工作液（0.15 mol/L磷酸緩沖液中分別加入1.48 mmol/L 4-AA，3.0 IU/mL POD，0.5 IU/mL COD，0.01 mmol/L苯酚，pH 7.0），將兩者按照1∶2的比例混合，再加入適量酶液，充分混合后于37℃水浴條件下反應15 min，以滅活酶液作為對照，測量波長500 nm處的紫外吸光度值，平行3次，取平均值。

酶活定義：在測定條件下，每分鐘催化1μmol底物水解所消耗的酶量為一個酶活單位（IU）。

1.3.3 菌株鑒定

（1）菌株形態學鑒定

將試驗菌株在固體培養基（LB瓊脂平板）上劃線，30℃恒溫培養，觀察菌株單菌落形態特征，挑取單菌落，進行革蘭氏染色，觀察單個菌株形狀、大小、排列方式等并拍照記錄。

（2）菌株生理生化特征鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]及《微生物實驗技術》[16]鑒定試驗菌株的生理生化特征。

（3）菌株分子生物學（16S rDNA）鑒定

提取復篩得到的試驗菌株的基因組DNA，以它為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），將反應產物送至上海生工進行電泳分析與雙向測序。在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網站上的GenBank數據庫中，將測序結果通過BLAST與已知菌種的16S rDNA序列進行同源性比對，確定目的菌株的種屬。選擇若干條同源性較高的已知菌株的序列，在MEGA6.06軟件中利用Neighbor-Joining法（Bootstrap參數為1 000）構建系統發育樹，確定其分類地位。1.3.4酶學性質的初步研究

（1）甾醇酯酶最適作用溫度

依據甾醇酯酶活性的測定方法，分別在不同溫度條件下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）對發酵得到的粗酶液進行酶活測定[12]。將同組實驗中最高酶活的相對值設為100%，做3組平行實驗。

（2）甾醇酯酶的熱穩定性

將發酵得到的粗酶液在不同的溫度條件下（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）水浴靜置2 h，立即冷卻，依據甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設為100%，做3組平行實驗。

（3）甾醇酯酶最適作用pH

分別向不同pH值（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的緩沖溶液中加入發酵得到的粗酶液，依據甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設為100%，做3組平行實驗。

（4）甾醇酯酶的pH穩定性

在最適作用溫度條件下，向不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的緩沖液中加入粗酶液，靜置2 h，依據甾醇酯酶活性測定方法測定酶活，將同組實驗中最高酶活的相對值設為100%，做3組平行實驗。

（5）不同化學物質對甾醇酯酶活性的影響

以原始的發酵粗酶液為對照，設定其相對酶活為100%，向原始發酵粗酶液中分別加入一定濃度的各類化學物質，測定甾醇酯酶活性，做3組平行實驗。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

從渤海灣海泥海水樣品中初步篩選分離得到了7株具有甾醇酯酶活性的菌株，從中選取一株長勢良好、產甾醇酯酶活性較高的菌株，命名為Q-06。在-20℃條件下對菌株進行甘油保藏，用于后續實驗。

2.2 菌株形態學鑒定

圖1 菌株Q-06菌落形態（A）及顯微形態（B）Fig.1 Colonial morphology(A)and microscopic morphology(B)of strain Q-06

從圖1可以看出，菌株Q-06的單菌落較小，近似圓形，邊緣整齊，呈淡黃色，不透明，菌落濕潤，用接種環易挑取；在顯微鏡下可觀察到菌株呈桿狀，自由排列，革蘭氏染色結果呈陰性。

2.3 菌株生理生化特性

參照《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株Q-06進行生理生化試驗，結果見表1。

表1 菌株Q-06的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain Q-06

由表1可知，菌株Q-06生理生化特征如下：氧化酶試驗、接觸酶試驗呈陽性，能夠氧化分解葡萄糖，不能還原硝酸鹽，伏普（VP）試驗、硫化氫產生試驗、甲基紅（methyl-red，MR）試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗均呈陰性，精氨酸雙水解酶試驗、吲哚乙酸試驗呈陽性。根據菌株菌落形態特征，顯微觀察及《常見細菌系統鑒定手冊》，初步鑒定該菌株為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）

2.4 分子生物學（16S rDNA）鑒定與系統發育樹的構建

對菌株Q-06的DNA樣品進行PCR擴增目的片段，并進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。由圖2可知，經PCR擴增得到產物序列長度為1 489 bp。

圖2 菌株Q-06 16S rDNA PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Electrophoregram of 16S rDNA PCR amplification products of strain Q-06

將菌株Q-06的16S rDNA測序結果提交至GenBank數據庫，從中選出同源性高的序列與菌株Q-06的16S rDNA基因序列進行比對，用MEGA6.06軟件構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株Q-06與Pseudomonas fragi strain（NR 112077.1）相似系數接近100%，在系統發育樹上聚于同一分支。因此，可以鑒定菌株Q-06為莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）。

圖3 菌株Q-06的16S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Q-06 based on 16S rDNA sequences

2.5 酶學性質研究

2.5.1 甾醇酯酶最適作用溫度

由圖4可知，當作用溫度低于30℃時，該甾醇酯酶活性隨著溫度升高而逐漸增大，30℃為最適反應溫度，酶促反應溫度達到40℃后，酶活性急劇下降，在25～40℃的范圍內，相對酶活可保持70%以上，溫度高于45℃時，相對酶活在50%以下。由此可以看出該甾醇酯酶對高溫條件比較敏感，并且在低溫條件下的活性相對較高。這一特性可能會有利于該低溫酶在實際生產中的應用[17]。

圖4 甾醇酯酶最適作用溫度曲線Fig.4 Optimal reaction temperature curve of the sterol esterase

2.5.2 甾醇酯酶的熱穩定性

對發酵粗酶液進行不同溫度的水浴處理，2 h后測定酶活性，結果見圖5。由圖5可知，發酵粗酶液在25～40℃條件下處理2 h后依然能保持高酶活性。但當溫度由30℃逐漸升高時，酶活性呈逐漸下降的趨勢，在45℃處理2 h后，相對酶活不足40%。由此判斷，該菌株產酶的熱穩定性較低。

圖5 甾醇酯酶的熱穩定性Fig.5 Thermostibility of the sterol esterase

2.5.3 甾醇酯酶的最適作用pH及穩定性

由圖6可知，該甾醇酯酶的最適作用pH值為7.0，為中性酶。當pH值≤6.0或≥8.0時，酶活性較低；pH在6.5～8.0的范圍內，其酶活可保持70%以上；觀察該甾醇酯酶的pH穩定性折線可知，在pH 7.0～8.0的范圍內，酶活可保持在80%以上，當pH≥8.5時，活性迅速下降。由此可以判斷：在中性至弱堿性條件下，甾醇酯酶活性較高，較穩定，即該甾醇酯酶有一定的耐弱堿性。

圖6 甾醇酯酶的最適pH及其pH穩定性曲線Fig.6 Optimal pH and pH stability curve of the sterol esterase

2.5.4 不同化學物質對酶活性的影響

由表2可知，不同的金屬離子對甾醇酯酶酶活性影響不盡相同。其中，Ag+有較強的抑制作用，Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe3+也能不同程度地抑制甾醇酯酶活性，Zn2+、Mg2+、Ca2+對酶活影響比較微弱。金屬螯合劑乙二酸四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、蛋白質變性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）均可對甾醇酯酶活性產生強烈的抑制作用。

表2 不同化學物質對甾醇酯酶活性的影響Table 2 Effect of different chemical substances on sterol esterase activity

3 結論

本研究所使用的出發菌株篩選自渤海灣的海泥海水樣品，先后通過初篩與復篩獲得了一株高產甾醇酯酶菌株，命名為Q-06。菌株Q-06經過形態特征、生理生化實驗和16SrDNA序列分析等綜合檢測，被鑒定為莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）。初步探索其產甾醇酯酶的酶學特性，結果顯示，該菌株產甾醇酯酶的最適作用溫度和pH值分別為30℃和7.0。該酶屬于低溫酶類，但隨著溫度的變化，酶的穩定性變差，并且該酶表現出一定的耐弱堿性；Ag+對酶的抑制性較強，Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe3+也能不同程度地對甾醇酯酶活性產生抑制作用，而Zn2+、Mg2+、Ca2+則對酶的作用比較微弱，基本無影響；EDTA及SDS均對甾醇酯酶的活性表現出明顯的抑制性。與國內外篩選的其他產甾醇酯酶的菌株相比[18-20]，該酶最適作用溫度低，在低溫下具有高酶活力及高催化效率。因此，菌株Q-06作為一株產甾醇酯酶的新菌源，具有潛在的開發價值。下一階段將從甾醇酯酶的分離純化及菌株產酶優化等方面進行深入探究，以期為甾醇酯酶的規模化發酵奠定理論基礎。