鼻咽癌組織中LMP1和VEGF蛋白的檢測結果及意義

張逸錚 魯明 阮神炯 鄭朝暉

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）為常見的頭頸部惡性腫瘤，患者大部分來自東南亞地區以及我國南方地區，福建省是鼻咽癌的高發區之一，其病因和EB病毒（epstein-barr virus，EBV）感染、癌基因、抑癌基因結構及功能改變等多種因素密切相關，它的臨床病理特點是低分化性與高轉移性，癌癥的侵襲及轉移直接影響到該疾病的治療效果。EB病毒感染和鼻咽癌之間的關系最為密切[1]，EB病毒潛伏膜蛋白1（latent membrane protent l，LMP1）是EBV在鼻咽癌細胞中起到重要作用的癌蛋白[2-3]，和鼻咽癌轉移有密切關系，它通過對多條信號通路進行調控進而對鼻咽癌的侵襲以及轉移產生不同程度的影響，并可通過活化不同信號通路促進腫瘤的淋巴結轉移及遠處轉移，一直以來其為各個實驗室分析研究的重點對象，同時發現LMP1是促進鼻咽癌發生和轉移的主要基因之一，對預測鼻咽癌轉移傾向有重要價值[4-5]。VEGF家族的不同成員是調節內皮細胞的調節因子，其具有控制內皮細胞存活、血管通透性、血管發生、淋巴血管生成以及血管生成的作用[6]。本次研究主要通過檢測鼻咽癌組織中LMP1蛋白與VEGF蛋白的表達，以及血清中VEGF的表達，以了解鼻咽癌的發生、發展、浸潤和轉移復發等生物學特性，從而為鼻咽癌的綜合治療以及基因治療提供參考，內容如下。

1 資料和方法

1.1 資料

收集福建醫科大學附屬第二醫院2014年1月—2016 年12月經病理確診為鼻咽癌和鼻咽部腺樣體切除組織的歸檔石蠟包埋塊，其中鼻咽癌22例，鼻咽腺樣體標本14例。將石蠟重新切片HE染色后，再次經本院病理科兩位醫師診斷證實并進行病理分型。將收集的組織標本分為鼻咽癌組和對照組，再將鼻咽癌組中的組織標本分為伴有頸部淋巴結轉移組和不伴有頸部淋巴結轉移組。詳細病例數如下：鼻咽癌組22例，其中男13例，女9例，年齡25～72歲，平均年齡為（45.00±12.92）歲；伴頸部淋巴結轉移鼻咽癌組織標本15例，不伴頸部淋巴結轉移鼻咽癌組織7例；鼻咽癌組織標本病理分型：非角化性癌分化亞型5例，非角化性癌未分化型17例；根據國際抗癌聯盟（UICC）頭頸腫瘤臨床分期第6版（2002年）對鼻咽癌進行TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期9例、Ⅲ/Ⅳ期13例；鼻咽炎組14例，其中男7例，女7例，年齡26～58歲，平均年齡為（42.93±12.56）歲。所有患者在收集組織標本時均未接受過放療、化療等臨床治療，鼻咽癌患者有無頸部淋巴結轉移根據患者磁共振（MRI）和CT檢測報告確定，對照組標本來源于腺樣體切除后標本。本研究經過福建醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審查通過。

1.2 方法

用免疫組化方法測定LMP1蛋白水平，主要包括石蠟切片預處理準備、切片抗原修復、消除內源性過氧化物酶、非特異性封閉、免疫反應以及顯色復染。用酶聯免疫吸附法測定VEGF蛋白水平，抽取患者4 mL外周靜脈血，在4℃3 000r/min離心10 min，將分離出的血清保存于-70℃中保存，隨后用VEGF-ELISA試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行，顯色后用酶標儀比色測定OD值，根據矯正曲線求出VEGF數值。

1.3 統計學分析

使用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析，計數資料用（n，% ）描述，組間差異比較采用χ2檢驗，不適用χ2檢驗，則采用Fisher確切概率法；計量資料用（x-±s）表示，采用t檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽炎組和鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達

利用免疫組化法檢測對照組和不同淋巴轉移分期（不同N分期）的鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達水平。鼻咽癌組中LMP1蛋白表達的陽性率為68.18% （15/22），在對照組中LMP1蛋白表達的陽性率 14.29% （2/14）；對各組LMP1蛋白的表達水平進行對比，鼻咽癌組LMP1蛋白的表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 鼻咽癌伴或不伴淋巴結轉移組中LMP1蛋白的表達

鼻咽癌組中伴有淋巴結轉移的LMP1蛋白表達陽性率為73.33% （11/15），鼻咽癌組中不伴有頸部淋巴結轉移的LMP1蛋白表達陽性率為57.14% （4/7）。鼻咽癌組伴有頸部淋巴結轉移鼻咽癌中LMP1蛋白的表達水平和不伴有頸部淋巴結轉移鼻咽癌中的表達水平之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 不同臨床參數鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達情況

采用Fisher確切概率法分析鼻咽癌各臨床參數中LMP1蛋白的表達分布情況，發現在鼻咽癌患者性別、年齡、病理分型中LMP1蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。在鼻咽癌的TNM分期中LMP1蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 鼻咽炎組和鼻咽癌組中VEGF蛋白的表達

VEGF在鼻咽癌組織中陽性表達率為59.09% （13/22），顯著高于鼻咽炎組7.14% （1/14），差異具有統計學意義（P＜0.05）。有頸淋巴結轉移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達率為73.33% （11/15），無頸淋巴結轉移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達率為28.57% （2/7），差異具有統計學意義（P＜0.05），見表4。

2.5 不同臨床參數鼻咽癌組血清中的VEGF蛋白的表達情況

ELISA法檢測血清VEGF蛋白水平，結果表明鼻咽癌患者血清VEGF水平為（468.31±20.23）ng/L，高于對照組（65.13±22.42）ng/L，差異具有統計學意義（t=55.906，P＜0.001）；血清VEGF水平有淋巴結轉移者顯著高于無轉移者（t=3.708，P＜0.001）；晚期（III+IV期）患者血清VEGF水平顯著高于早期（I+II期）患者（t=9.556，P=0.038）；VEGF水平與患者性別以及年齡差異無統計學意義（性別t=0.093，P=0.927；年齡t=0.828，P=0.418），見表5。

3 討論

在中國，鼻咽癌有非常明顯的區域分布特征，大部分集中于我國南方五省：廣東、廣西、福建、江西以及湖南省[7]，在這些地區，鼻咽癌的發病率占頭頸部惡性腫瘤之首。近年來，鼻咽癌的發病率有上升的趨勢，且好發于鼻咽頂后壁，其次為側壁。鼻咽癌的發生主要和三個因素有關，分別是遺傳、環境以及病毒因素[8]。

表1 鼻咽炎組和鼻咽癌組中LMP1 蛋白的表達[例（% ）]

表2 鼻咽癌伴或不伴淋巴結轉移組中LMP1 蛋白的表達[例（% ）]

表3 不同臨床參數鼻咽癌組中LMP1蛋白的表達情況[例（% ）]

表4 鼻咽癌伴或不伴淋巴結轉移組中VEGF蛋白的表達[例（% ）]

表5 不同臨床參數鼻咽癌組血清中的VEGF蛋白的表達情況[（x±s）]

研究發現鼻咽癌在發生頸部淋巴結轉移的過程中，EB病毒能夠發揮多種作用，如持續不斷的表達癌蛋白，降解細胞外面的基質，減少細胞之間的粘接，在異常細胞的轉移中發揮非常關鍵的作用[9]。這類病毒中最為突出的是LMP1蛋白，其促進了腫瘤血管生成并推動了癌細胞的轉移擴散，屬于癌基因的一種。EB病毒是非常常見的皰疹病毒，大部分人都是隱性感染狀態[10-11]。EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP1）是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，被認為是EBV的主要致瘤蛋白，它是一種整合膜蛋白，它包括CTAR-1、CTAR-2以及CTAR-3三個功能區，三個功能區利用存在于細胞膜和高爾基體中的物質活化多種信號通路促進鼻咽癌的發生發展[12]。LMP1能夠提高鼻咽癌細胞的運動能力，利用細胞內的信號轉導系統對細胞基質進行降解，增大癌細胞的侵入以及轉移能力。本研究應用免疫組化檢測鼻咽癌組和對照組中LMP1蛋白表達水平，鼻咽癌組LMP1 蛋白表達陽性率明顯高于對照組LMP1 蛋白表達陽性率，其差異有統計學意義。但LMP1蛋白的表達與年齡、性別、病理分型無明顯相關性，表達無統計學意義。通過統計分析比較在鼻咽癌組中伴有頸部淋巴結轉移者LMP1的陽性率和無頸部淋巴結轉移者LMP1的陽性率無明顯差異，與龔梁研究結果不一致，通過對該實驗討論分析，出現該結果可能有如下原因：本實驗對照組及實驗組樣本數量偏少，尤其是對照組，而且后期詢問抗體公司發現抗LMP1單克隆抗體特異性不強，以致對LMP1蛋白在有無頸部淋巴結轉移中的陽性率產生偏差，但LMP1蛋白表達陽性率在鼻咽癌組仍大于對照組陽性率，仍具有一定的參考意義。建議后期使用原位雜交技術來檢測EBV病毒的mRNA更具有代表性。

VEGF是一種有效的血清形成和通透性誘導因子，其在人體的許多正常組織中低水平表達，在多種實體瘤等病理情況下，其表達異常升高，而且隨著腫瘤惡性程度增加而呈現遞增的趨勢。在本次研究中 VEGF在鼻咽癌組織中陽性表達率為73.33% （11/15），顯著高于對照組28.57% （2/7），差異具有統計學意義（P＜0.05）；有頸淋巴結轉移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達率為73.33% （11/15），無頸淋巴結轉移的鼻咽癌組織中VEGF陽性表達率為57.14% （4/7），差異具有統計學意義（P＜0.05）；血清VEGF水平有淋巴結轉移者顯著高于無轉移者（P＜0.05）；晚期（III+IV期）患者血清VEGF水平顯著高于早期（I+II期）患者（P＜0.05）；VEGF水平與患者性別以及年齡差異無統計學意義（P＞0.05），提示VEGF表達水平可作為判斷鼻咽癌淋巴結轉移的重要指標。

綜上所述，鼻咽癌是人類一種復雜的惡性腫瘤，相關癌基因和相關抑癌基因的異常參與了鼻咽癌的發生、發展、侵襲和轉移等過程。