日照海岸線可培養放線菌的抑菌活性及其多樣性研究

梁光杰，車程川，曹 利，鞏志金，劉金鋒，姜曰水，孫 萍，劉寶晴，楊 革*

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

放線菌是細菌中較大的門之一，屬于革蘭氏陽性菌，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）中含有較高的鳥嘌呤（guanine，G）+胞嘧啶（cytosine，C）含量[1]。放線菌因其能產生具有重大經濟意義的次級代謝產物和其他具有藥用意義的化合物被認為是重要的微生物[2-4]。近幾十年來，有研究[5-7]已從陸地環境中分離到大量放線菌菌株，并對陸生放線菌的多樣性及其次級代謝產物進行了廣泛深入的研究，取得了一系列成果。但從陸生放線菌中發現新的放線菌菌株及產具有生物活性化合物的放線菌變得日益困難。

由于海洋特殊的生長環境，如高鹽度、高壓力和較低的溫度，海洋微生物多種多樣且產生多種生物活性的次生代謝產物[8]。隨著海洋資源的開發，包括海水[9]、海洋冰雪和海洋沉積物[10]，在海洋環境中產生新型生物活性次級代謝物的放線菌引起了越來越多的關注[11-14]。MALDONADO L A等[15]對加利福尼亞灣海洋沉積物的研究發現近300株放線菌，屬于馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、迪茨氏菌屬（Dietzia）、戈登氏菌屬（Gordonia）、小單孢菌屬（Micromonospora）、野野村菌屬（Nonomuraea）、紅球菌屬（Rhodococcus）等。在30個有代表性的屬中，鏈霉菌屬是最豐富的種屬，而其他20個屬，如小單胞菌屬（Micromonospora）和鹽孢菌屬（Salinispora）則較少。然而，這兩個屬在其他海洋生態系統中被報道為優勢屬[16-19]，說明海洋環境中具有豐富的放線菌資源。

日照海岸線位于黃海以東、渤海與黃河三角州之間，其獨特的地理位置形成了優越的生態環境，豐富的微生物資源遠未開發。因此，本研究對該海岸線海洋放線菌進行篩選，并對其抑菌活性及多樣性進行研究，為今后該地區放線菌資源和海洋新藥的開發提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、產氣桿菌（Aerobacter aerogenes）CGMCC 1.183、變形桿菌（Proteus）CGMCC 1.491、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGMCC 1.15148、黃曲霉（Aspergillus flavus）CGMCC 3.3950：均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、碳酸鈣、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、苯酚、磷酸氫二鈉、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鎂（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；腐殖酸、甘油、精氨酸、幾丁質、海藻糖、脯氨酸、酪蛋白、丙酸鈉、萘啶酮酸、制霉菌素、放線菌酮（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；革蘭氏陽性細菌DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養基

腐殖酸（humic vitamin acid，HVA）培養基：腐殖酸1 g，CaCO30.02 g，Na2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 1.7 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，維生素B（vitamin B，VB）1 mL，瓊脂18 g，水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

甘油精氨酸（glycerine arginine，GA）培養基：甘油6mL，精氨酸1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。115℃滅菌30 min。

M4培養基：幾丁質2 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

海藻糖脯氨酸瓊脂（trehalose proline agar，TPA）培養基：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO41 g，VB 1 mL，瓊脂18 g，水1 000 mL。115℃滅菌30 min。

酪蛋白丙酸鈉瓊脂（casein sodium propionate agar，CSPA）培養基：酪蛋白2 g，丙酸鈉4 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO40.5 g，CaCO32 g，瓊脂18 g。115 ℃滅菌30 min。

以上所有篩選培養基都用自然海水配制，調節pH至7.5～8.0，并且加入萘啶酮酸（25μg/mL）、制霉菌素（50μg/mL）、放線菌酮（50μg/mL）抑制細菌跟真菌的生長[20]。

高氏一號（M1）液體培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，KH2PO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaCl 0.5 g，水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

M1固體培養基：在M1液體培養基中加入瓊脂18 g。

1.2 儀器與設備

DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養箱；Lab-Therm LT-X振蕩培養箱：比歐科技國際發展有限公司；1-14小型臺式離心機、3-18KS高速冷凍離心機：美國Sigma公司；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器：德國默克密理博公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌鍋：日本ALP公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

樣本采集于日照海岸線的海洋沉積物、泥沙和沙子，采樣地點被編號為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9和T10，共采集了35份樣本于4℃條件下儲存，用于篩選菌株。樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

1.3.2 放線菌的篩選

使用不同的預處理方法和培養基篩選放線菌。預處理方法1（F1）：樣品自然風干14 d；預處理方法2（F2）：121 ℃真空干燥2 h；預處理方法3（F3）：樣品按照1∶10（g∶mL）料水加入1.5%苯酚溶液，在30℃條件下浸泡30 min[21]；預處理方法4（F4）：樣品按照1∶10（g∶mL）料水比加入無菌水在55 ℃條件下加熱15 min[22]；預處理方法5（F5）：采用差速離心法（dispersion and differential centrifugation，DDC）法對樣品進行處理[23]。預處理后的樣品用25%林格氏液進行梯度稀釋。取100 μL梯度稀釋的樣品懸液（10-1、10-2、10-3、10-4）涂布于篩選培養基（HVA培養基、GA培養基、M4培養基、TPA培養基、CSPA培養基）上。

涂布好的篩選培養基于28℃條件下靜置培養1～4周，然后采用M1固體培養基對生長出來的放線菌進行分離純化，將純化后的放線菌保藏于-80℃，備用。

1.3.3 抑菌活性測試

將篩選出的放線菌接種至M1液體培養基中，28℃、180 r/min條件下培養14 d，發酵液經10 000 r/min離心10 min，取上清。收集的上清液經0.22μm過濾器過濾，4℃儲存，用于抑菌活性測試。

使用牛津杯法測定所篩選菌株的抑菌活性[24]。吸取0.2 mL指示菌菌液到培養基表面，涂布均勻，在培養基表面垂直擺放牛津杯，輕輕安放，使其與培養基接觸無空隙，在牛津杯中加入0.2 mL發酵上清液，于一定條件下培養。其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌于37℃條件下培養24 h，黃曲霉于28℃條件下培養72 h。培養結束后，按照十字交叉法采用游標卡尺測抑菌圈直徑。

1.3.4 放線菌多樣性分析

基因組DNA的提取：將放線菌菌株接種到50 mL M1液體培養基中，28℃、180 r/min條件下培養2 d。12 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，使用革蘭氏陽性細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

16SrRNA基因PCR擴增：通過PCR擴增放線菌的16S rRNA基因，所用的引物為引物A（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和引物B（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。PCR反應體系為基因組DNA 2μL，2×Master Mix 25μL，引物A和B各2μL，雙蒸水（ddH2O）19μL。反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸75 s，共35個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物送往濟南力戈科技有限公司進行測序。

系統發育樹分析：將測序結果與美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中的序列進行比對[20]，采用分子進化遺傳學分析軟件MEGA 5.0中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構建系統發育樹[25]。

2 結果與分析

2.1 可培養放線菌的篩選

從日照海岸線采集了35份海洋樣本，采用不同的篩選培養基及預處理方法進行放線菌的篩選。培養1～4周后，根據菌落形態特征挑選單菌落，并在M1固體培養基上進一步分離純化，共分離到208株放線菌，不同類型樣品中所篩選到的放線菌數量結果見表2。

表2 不同類型樣品中所篩選到的放線菌數量Table 2 Number of Actinobacteria isolated from different samples

由表2可知，從海洋沉積物樣品中分離的放線菌數量（173株）遠遠高于從泥沙（30株）和沙子（5株）樣品中分離的放線菌數量，原因可能是海洋沉積物樣品中含有豐富的各種營養物質，有利于放線菌的附著、生長和繁殖。不同采樣地點、培養基種類及預處理方法條件下所篩選到的放線菌數量結果見圖1。

圖1 不同條件下篩選到的放線菌數量Fig.1 Number of Actinobacteria isolated under different conditions

由圖1a可知，從采樣點T9樣品中篩選到的放線菌數量最多，為55株，然后依次是T3（50株）、T1（28株）、T4（23株）、T5（17株）、T6（12株）、T8（11株）、T2（7株）、T7（3株）、T10（2株），表明采樣點T1、T3、T9具有開發海洋放線菌資源的巨大潛力，并且為以后進一步開發日照海岸線放線菌資源提供了地理位置信息。YUAN M等[20，26]對世界其他海域的放線菌進行了篩選。如ATALAN E等[23]從Chukchi Shelf海洋沉積物中篩選到73株放線菌；SOLANO G等[26]從北太平洋及哥斯達黎加的加勒比海岸中篩選到137株放線菌。而本研究從日照海岸線中共篩選出208株放線菌，說明日照海岸線具有豐富的放線菌資源。

鑒于大多數海洋放線菌不能從一種培養基中獲得，因此使用適當的分離培養基來改善放線菌的篩選至關重要[27]。本研究采用5種不同的培養基對放線菌進行篩選。

由圖1b可知，采用CSPA培養基篩選到的放線菌數量最多（97株）。其他培養基HVA、GA、TPA、M4所篩選出來的放線菌數量依次為34、30、30、17株，表明CSPA培養基更適合該地區的放線菌的篩選。原因可能是CSPA培養基中含有丙酸鈉，丙酸鈉可以抑制部分細菌和真菌的生長，從而降低其與放線菌的競爭作用，更加有利于放線菌的生長，而且本研究中所有培養基都采用日照海岸線的自然海水配制，最大還原了放線菌生長的自然環境，所以有利于放線菌的篩選。

由圖1c可知，預處理方法F5篩選到的放線菌數量最多，為75株，其他預處理方法F3、F1、F4、F2所篩選到的放線菌數量依次為58株、38株、28株、9株。原因可能是預處理方法F5以去氧膽酸鈉為弱的表面活性劑，綜合運用了物理化學手段（超聲、振蕩、化學溶劑），能盡可能的破壞樣品顆粒的聚集將放線菌釋放出來，再通過細度分選、分步收集，將樣品中混生的微生物有效的分離出來。

2.2 放線菌的抑菌作用

對所篩選的208株放線菌進行抑菌活性測試，其中91株放線菌至少對一種病原體表現出抑制作用。不同采樣地點所篩選出的具有抑菌效果的放線菌數量見表3。

表3 不同采樣地點所篩選到的具有抑菌效果的放線菌數量Table 3 Number of Actinobacteria with antibacterial activities isolated from different sampling sites

由表3可知，采樣點T9、T3、T1所篩選到的具有抑菌活性的放線菌數量較多，分別為27株、22株、16株，說明這3個采樣點含有豐富的具有抑菌活性的放線菌。在91株具有抑菌活性的放線菌中，抑制各個指示菌的放線菌數量見圖2。

由圖2可知，在91株具有抑菌活性的放線菌中，38.46%（35株）的放線菌對產氣桿菌具有抑制作用，27.47%（25株）的放線菌對變形桿菌具有抑制作用，18.68%（17株）的放線菌對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，9.89%（9株）的放線菌對大腸桿菌具有抑制作用，2.2%（2株）的放線菌對銅綠假單胞菌具有抑制作用，3.3%（3株）的放線菌對黃曲霉具有抑制作用。其中抑菌活性較好的25株放線菌的抑菌活性見表4。

圖2 抑制各個指示菌的放線菌數量Fig.2 Number of Actinobacteria inhibiting each indicator microbes

表4 25株放線菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of 25 Actinobacteria

由表4可知，25株放線菌對指示菌的抑菌圈均≥10 mm，顯示出良好的抗菌活性（牛津杯的直徑為6 mm，抑菌圈直徑＞6 mm被認定具有抑菌活性[28]），其中菌株F8、Y6和B11具有廣譜抗菌活性，菌株Y6、C、F8和B11的抗菌活性透明圈見圖3。

圖3 菌株B11、F8、C及Y6的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of strains B11,F8,C and Y6

2.3 放線菌多樣性分析

選取上述25株具有良好抑菌活性的放線菌進行16S rRNA基因序列分析。將25株放線菌的16S rRNA基因序列提交至NCBI，獲得GenBank登錄號。25株放線菌菌株的GenBank登錄號及其16S rRNA基因與其他菌株的相似性見表5，系統發育樹見圖4。

由表5及圖4可知，基于16S rRNA基因序列分析，將25株放線菌菌株初步分為22個種系，3個不同的屬。其中鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）菌株數量最多（18株），其次是擬諾卡氏菌（Nocardiopsis sp.）（4株）和糖單胞菌屬（Saccharomonospora）（3株）。結果表明，本研究中分離的放線菌表現出一定的多樣性，且鏈霉菌屬為優勢菌屬。與SOLANO G等[26，29-30]的研究結果一致，說明在大多數海洋環境中鏈霉菌屬在放線菌中是優勢菌屬。

有研究表明[31-33]，鏈霉菌屬是新型抗生素的生產者，大約75%用于商業生產的抗生素來自鏈霉菌。如Stretomyces sannanensis可以產生新的化合物（氨基糖苷類抗生素、sannamycinsA、B和C）來抑制革蘭氏陽性細菌[34-35]；從海洋鏈霉菌（Streptomyces sp.）MSU5中分離出具有抗鉤端螺旋體潛力的化合物細霉素B等[36-38]。由此可見，本實驗中篩選到的鏈霉菌具有很大的開發價值。

表5 25株放線菌菌株的GenBank登錄號及其16S rRNA基因序列與其他菌株的相似性Table 5 GenBank accession number and similarity of 16S rRNA gene sequences of 25 Actinobacteria strains with other strains

圖4 25株放線菌菌株基于16S rRNA基因序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 25 Actinobacteria strains based on 16S rRNA gene sequences

3 結論

本研究從日照海岸線不同地區樣品中共分離到208株放線菌，其中91株具有抑菌活性。35株對產氣桿菌有抑制作用，25株對變形桿菌有抑制作用，17株對金黃色葡萄球菌有抑制作用，9株對大腸桿菌有抑制作用，2株對銅綠假單胞菌有抑制作用，3株對黃曲霉有抑制作用。25株抗菌活性較好的菌株經分子生物學鑒定，分為22個種，3個不同的屬：鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）18株，擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis sp.）4株和糖單孢菌屬（Saccharomonospora sp.）3株。結果表明，日照海岸線具有豐富的放線菌資源，鏈霉菌屬為優勢菌屬，為今后該地區放線菌資源及新型海洋藥物的開發奠定了基礎。