響應面優(yōu)化微波結合木聚糖酶制備稻殼低聚木糖工藝研究

關海寧，趙曉偉，刁小琴，黃秀琦，馬 可

（綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061）

稻殼約占稻谷質量的20%，含有約40%粗纖維和20%五碳糖聚合物及少量的粗脂肪、蛋白等有機物[1-2]。稻殼外殼堅硬，不易被土壤消化，同時較低的營養(yǎng)價值使其不適宜作飼料，因此產量較大的稻殼就會造成環(huán)境污染，放置時間較長還會容易發(fā)生自燃，如何充分利用稻殼是當前急需解決的問題。低聚木糖是由2～7個木糖分子以β-1,4糖苷鍵聯(lián)結而成的功能性聚合糖，以木二糖和木三糖為主[3-4]，具有安全、無毒、低熱、耐酸、耐熱等良好的理化特性，還具有促進雙歧桿菌增值，保護肝臟、降血壓、增強機體免疫力等重要生理功能[5-8]，廣泛應用于醫(yī)藥、功能性食品、飼料添加劑等方面[9-10]。

目前低聚木糖的提取方法常用酸水解法，利用該法水解不僅要求設備要防止酸腐蝕，而且需要耐高溫、高壓，需要的成本較高，同時木聚糖在酸性條件下水解速度較快，在低聚木糖水平上較難控制且還會產生較多的有害物質，使得到的低聚木糖質量較低[11]。近些年，微波技術由于其升溫速度快，熱效率高，能量傳遞迅速且利用充分，細胞內有效成分能快速溶出[12-13]等優(yōu)點，被廣泛應用于植物有效成分的提取方面，而且微波技術不需要太多的溶劑，被視為清潔高效的提取技術[14]。木聚糖酶是能夠降解木聚糖的最主要酶之一，能進行定向酶水解生產低聚木糖[15]。李秀婷等[16]報道，木聚糖酶能使玉米芯中的水不溶性木聚糖產生木二糖、木三糖及木四糖等含量較高的低聚糖，合理利用木聚糖酶，能夠提高玉米芯的利用率。

本試驗采用微波預處理結合木聚糖酶法制備稻殼中的低聚木糖，在單因素試驗的基礎上采用Box-Behnken試驗設計和響應面分析對制備工藝進行優(yōu)化，以獲得最佳工藝條件，為稻殼的工業(yè)化生產提供實踐基礎，對稻殼的利用與處理具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻殼：黑龍江綏化某稻米廠提供，粉碎備用；木聚糖酶（50 000 U/g）：鄭州萬博食品配料有限公司；低聚木糖（純度≥98%）：上海展云化工有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海伊卡生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；M1-L202B美的微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波-木聚糖酶制備工藝

將剔除雜物的稻殼磨碎，稱取3.0 g，置250 mL的錐形瓶中，加入檸檬酸緩沖液（pH 5.0）9 mL攪拌均勻，于一定的微波功率條件下處理一定的時間，取出晾涼后加入一定量的木聚糖酶，再加入檸檬酸緩沖液（pH 5.0）使料液比達到1∶20（g∶mL），在50 ℃水浴鍋中酶解一定的時間后，沸水浴滅酶，離心得上清液，定容至50 mL容量瓶中，待測。

1.3.2 單因素試驗

按照1.3.1的方法，分別研究微波功率（80 W、240 W、400 W、640 W、800 W），微波時間（2 min、3 min、4 min、5 min、6 min），酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），料液比為（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））對稻殼低聚木糖提取量的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計原理，以對制備低聚木糖含量有顯著影響的微波功率（X1）、酶解溫度（X2）及微波時間（X3）3個因素進行響應面分析試驗，以低聚木糖含量（Y）為響應值，確定稻殼低聚木糖制備的最佳工藝條件，試驗設計因素水平編碼見表1。

表1 低聚木糖制備條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization

1.3.4 測定方法

低聚木糖含量測定參照參考文獻[17]的方法，按下列公式計算：

式中：m′為從標準曲線中查得低聚木糖的質量，mg；V為樣品提取液總體積，mL；N為樣品提取液稀釋倍數(shù)；Vs為測定時所需樣品提取液的體積，mL；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 微波功率的影響

在不同微波功率條件下微波5 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解2 h，考察不同微波功率對低聚木糖含量的影響，結果見圖1。

圖1 微波功率對低聚木糖含量的影響Fig.1 Effect of microwave power on xylooligosaccharide content

由圖1可知，微波功率＜640 W之前，低聚木糖含量隨微波功率的增大而提高；微波功率為640 W時低聚木糖含量達到最大，為4.24 mg/g；當微波功率＞640 W之后，低聚木糖含量明顯下降。原因可能是微波功率太小時，不足以提供足夠的熱使細胞破壁，更多的木聚糖不易暴露，進而使后續(xù)水浴酶解得到的低聚木糖含量相對較低，而較高的微波功率能夠增加微波的輻射能量[18]，有利于細胞壁的破壞，進而使更多的木聚糖暴露。但功率過高時，瞬間加熱致使過高的溫度對木聚糖的結構產生影響，導致后續(xù)水浴酶解低聚木糖含量降低。因此，選擇微波功率640 W為宜。

2.1.2 微波時間的影響

在微波功率640 W條件下，微波一定時間后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），50 ℃水浴酶解 2 h，考察不同微波時間對低聚木糖含量的影響，結果見圖2。

圖2 微波時間對低聚木糖含量的影響Fig.2 Effect of microwave time on xylooligosaccharide content

由圖2可知，微波時間＜3 min之前，隨著時間的延長，低聚木糖含量增大；當微波時間為3 min時，低聚木糖含量達到最大，為4.09 mg/g；微波時間＞3 min之后，低聚木糖含量又迅速下降。這可能是因為微波加熱升溫非常迅速，處理時間過短，低聚木糖暴露不充分；當處理時間過長時，可能導致部分低聚木糖結構破壞，使后續(xù)木聚糖酶水解木聚糖得到的低聚木糖含量降低。因此，微波時間以3 min為宜。

2.1.3 酶解溫度的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），一定溫度下水浴酶解 2 h，考察不同酶解溫度對低聚木糖含量的影響，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對低聚木糖含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on xylooligosaccharide content

由圖3可知，酶解溫度＜60℃之前，隨著溫度的升高，低聚木糖含量增大；當酶解溫度為60℃時，低聚木糖含量達到最大，為4.52 mg/g；酶解溫度＞60℃之后，低聚木糖含量開始下降。原因可能是酶解溫度過大不僅使酶發(fā)生了變性，而且得到的低聚木糖結構被破壞，低聚木糖的提取量降低，而酶解溫度太低，木聚糖酶活性較低，不能使木聚糖充分酶解。因此，酶解溫度以60℃為宜。張燕青等[15]報道，不同來源的木聚糖酶的最適溫度為50～60℃，溫度過高，會使酶的活性降低。

2.1.4 酶解時間的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，料液比 1∶20（g∶mL），60 ℃水浴酶解一定時間，考察不同酶解時間對低聚木糖含量的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對低聚木糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on xylooligosaccharide content

由圖4可知，酶解時間＜3 h之前，隨著酶解時間的延長，低聚木糖含量增大；酶解時間為3 h時，低聚木糖含量達到最大，為4.24 mg/g；當酶解時間超過3 h之后，低聚木糖含量增加的幅度減少且趨于平緩。原因可能是酶解時間太短不能使木聚糖充分酶解得到更多的低聚木糖，而當酶解時間達到3 h時，可能木聚糖酶解作用完成，低聚木糖基本完全溶出，也可能是得到的產物對酶的反饋抑制作用增強[19]，酶解時間繼續(xù)增加對提取量影響較小。因此，后續(xù)試驗酶解時間以3 h為宜。

2.1.5 料液比的影響

在微波功率640 W條件下微波3 min后取出晾涼，加入4%木聚糖酶，以一定的料液比（g∶mL）在60℃水浴酶解3 h，考察不同料液比對低聚木糖含量的影響，結果見圖5。

圖5 料液比對低聚木糖含量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on xylooligosaccharide content

由圖5可知，料液比增加的同時，低聚木糖含量呈上升趨勢。當料液比1∶5～1∶15（g∶mL）時，低聚木糖含量增加速度較快，當料液比1∶15～1∶25（g∶mL）時，低聚木糖含量增長速度趨于平緩。這可能是當料液比較小時，物料黏度過大，酶解得到的低聚木糖不能充分溶出[20]，當料液比為1∶15（g∶mL）時，低聚木糖基本全部溶出，繼續(xù)增加料液比，溶出的低聚木糖變化不明顯。因此，為了節(jié)省能源，提高效率，選擇料液比為1∶15（g∶mL）為最佳。

2.2 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，選取微波功率（X1）、酶解溫度（X2）及微波時間（X3）3個因素，以稻殼低聚木糖含量（Y）為響應值進行Box-Behnken試驗設計，確定3因素3水平，共15個試驗。其中12個析因點，3個0點，試驗結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數(shù)據進行多元回歸擬合分析，得到的回歸方程為：

回歸方程的方差分析結果見表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，說明該模型高度顯著，失擬項P=0.107 6＞0.05，說明失擬項不顯著，回歸方程對數(shù)據擬合較好，可以通過此模型來預測稻殼低聚木糖制備的最優(yōu)條件。回歸方程中，微波功率、酶解溫度、微波時間的一次項均達到極顯著水平（P＜0.01），說明這3個因素對低聚木糖含量的影響線性關系極顯著，微波功率與微波時間的交互作用達到顯著水平（P＜0.05），其響應面及等高線見圖6，其他因素交互作用不顯著。

表2 低聚木糖制備條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments for xylooligosaccharide preparation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Variance analysis results of the regression model

由圖6可知，響應曲面圖曲線陡峭、等高線形狀為橢圓形，說明微波功率與微波時間交互作用顯著，這一結果與表3方差分析結果一致。

圖6 微波功率與微波時間交互作用對低聚木糖含量影響的響應面（A）和等高線（B）Fig.6 Response surface plots(A)and contour line(B)of effects of interaction between microwave power and microwave time on xylooligosaccharide content

根據模型預測得到的最優(yōu)制備條件為微波功率637.04 W，酶解溫度58.89℃，微波時間3.19 min，在此條件下理論低聚木糖含量為5.00 mg/g，為檢測模型預測的可靠性及實際操作的便利性，制備工藝參數(shù)修正為微波功率640 W，酶解溫度59℃，微波時間3.2 min，在此優(yōu)化條件下，低聚木糖實際含量為4.94 mg/g，實際測定結果與理論值的相對誤差為1.2%，綜上所述，利用響應面法優(yōu)化制備稻殼低聚木糖合理可行。

3 結論

通過響應面法對微波預處理輔助木聚糖酶制備稻殼低聚木糖的工藝進行了優(yōu)化研究，結果表明，微波功率（W）、酶解溫度（℃）、微波時間（min）對低聚木糖含量的影響線性關系極顯著（P＜0.01），微波功率與微波時間的交互作用對低聚木糖含量的影響顯著（P＜0.05）。通過響應面分析得到了制備的最優(yōu)條件：微波功率640 W，微波時間3.2 min，酶解溫度59 ℃，酶解時間3 h，料液比1∶15（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，低聚木糖含量為4.94 mg/g。該研究為稻殼低聚木糖的制備提供了理論基礎，同時充分利用稻殼資源，將其變廢為寶，不僅能夠解決資源浪費問題，也能增加農民的收入。