應用Illumina MiSeq高通量測序技術解析梅干菜中細菌多樣性

尚雪嬌，王玉榮，楊 江，折米娜，趙慧君，郭 壯，2*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

梅干菜又稱梅菜，是以雪里蕻、芥菜或油菜為主要原料，經挑選、去根、清洗、除水、腌制和干制等傳統工藝制作而成的特色發酵蔬菜[1]。采用傳統方法生產梅干菜時，制作環境相對開放，使得梅干菜中的微生物豐富且多樣。然而，目前對梅干菜的研究多集中于風味物質和微量元素測定[2-3]、抑菌和抗氧化能力分析[4-5]以及工藝優化[6-7]等方面，有關其中微生物群落結構及多樣性的研究鮮見報道。

由于某些微生物的特殊生長需求及培養條件的限制，基于純培養的傳統微生物學手段只能將樣品中少于1%的微生物分離出來，而非培養技術的出現對于這個問題的解決提供了很好的幫助[8]。近年來，以Illumina MiSeq為代表的高通量測序技術發展迅速，為分析生境菌群多樣性提供了有力手段，該技術無需對樣品中微生物進行分離純化，可直接對樣本基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行分析，能夠快速、直接和真實的反映菌群物種豐度及差異[9-10]。

本研究采用Illumina MiSeq技術對采自恩施地區的梅干菜樣品中細菌多樣性進行解析，同時采用傳統微生物學手段對其中所含乳酸菌進行分離鑒定，以期為恩施地區梅干菜中微生物菌種資源的發掘與保護提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

梅干菜MGC01、MGC02和MGC03：主要原料為雪里蕻。于2017年12月采自湖北省恩施地區土橋壩菜市場。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、碳酸鈣、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉、酚、氯仿、異戊醇、溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）和醋酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養基：青島海博生物技術有限公司；Axygen清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發展有限公司；10×PCR Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、pMD18-T vector、Solution I：寶生物工程（大連）有限公司；6×Loading buffer、DL500和DL2000 DNA Marker：寶日醫生物技術（北京）有限公司；2×PCRmix：南京諾唯贊生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，各引物信息如表1所示。

表1 實驗所用引物序列信息Table 1 Sequences information of primers used in the study

1.2 儀器與設備

HR40-IIB2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；VeritiTM 96孔梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain re action，PCR）擴增儀：美國AB公司；DYY-12水平電泳儀：北京市六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；LRH-70生化培養箱：上海一恒科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；UV PCDS8000凝膠成像分析系統：美國BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因組DNA提取

參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒中的方法提取梅干菜樣品宏基因組DNA，并用微量紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度。

1.3.2 基于MiSeq高通量測序技術梅干菜細菌多樣性的評價

細菌16S rRNA擴增及測序：以微生物宏基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系[14]為5×FastPfu Buffer 4μL、2.5 mmol/LdNTPmix 2μL、5μmol/L的正/反引物（338F/806R）各0.8 μL、5 U/μL r Taq酶 0.4 μL、DNA模板 10 ng，雙蒸水（ddH2O）補充至20μL。PCR擴增條件為95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共循環30次；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

質量控制：對測回的序列進行拼接，拼接時去除重疊區域堿基數＞10 bp、最大錯配率＞0.2和樣品特異性條形碼（barcode）或引物堿基錯配的序列，拼接后依據barcode信息將序列劃分至各樣品中以備后續分析[15]。

數據分析：使用QIIME數據分析平臺，參照CAPORASO J G等[16]的方法對質控后的序列進行分析。首先以97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[17]，然后利用Greengenes[18]和RDP[19]數據庫進行同源性比對，統計各分類水平上細菌多樣性。

1.3.3 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

乳酸菌分離純化：采用稀釋涂布平板法將樣品稀釋液涂布于含1.0%～1.2%碳酸鈣的MRS瓊脂培養基上，37℃厭氧培養48 h后挑選周圍有透明圈的單菌落進行純化，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的純種菌株用30%的甘油進行菌種保藏。

乳酸菌DNA提取與鑒定：采用CTAB法[20]提取純化菌株的DNA，然后以提取的DNA為模板進行PCR擴增，除PCR擴增所需引物為27F和1495R外，PCR擴增體系和條件均與1.3.2相同。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、清潔后與PMD18-T載體連接并轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）Top10，挑取陽性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。將測序公司返回的序列進行拼接并去除正反引物后置于美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行同源性比對，選取同源性較高的菌株，使用Mega 7.0中的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 數據處理

使用折線圖評判本研究測序深度是否合適，使用維恩（Venn）圖顯示不同樣品中共有或特有的OTU及序列數，使用柱狀圖展示不同樣品中各門和屬水平細菌種類和含量，使用系統發育樹展現不同菌株間進化關系。折線圖和柱狀圖使用Origin2017軟件繪制。Venn圖由Venny2.1.0在線繪制，系統發育樹由Mega 7.0繪制。

2 結果與分析

2.1 基于Illumina MiSeq高通量測序技術梅干菜細菌多樣性的評價

高通量測序技術具有通量高、檢測速度快等優點，可更加準確、真實的反映樣本中微生物群落結構的組成。因此，首先使用Illumina MiSeq高通量測序技術對干梅菜樣品中細菌在門、綱、目、科和屬各水平上的分類數量進行統計，然后利用超1指數和香農指數對其物種豐度和多樣性進行分析，結果如表2所示。

表2 梅干菜樣品測序結果及各分類地位數量Table 2 Sequencing results and numbers at different taxonomical levels of preserved vegetable samples

由表2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03經質控合格后的序列分別為25 534條、27 773條和36 858條，在97%的相似度下劃分的OTU數分別為3 545個、2 528個和4 689個。當測序量為23 610條時，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03的超1指數分別為1 860、1 613和2 362，香農指數分別為7.02、5.79和7.73，其中梅干菜樣品MGC03的超1指數和香農指數值均最大，因而梅干菜樣品MGC03中細菌豐度和多樣性均高于梅干菜樣品MGC01和MGC02。進一步對測序深度是否能捕獲細菌多樣性信息進行了分析，結果如圖1所示。

由圖1可知，當序列數達到30 000條時，稀疏曲線隨序列數的增加而增加，而香農指數曲線在序列數＞10 000條時就已經進入平臺期，說明隨著測序深度的增加可能還會有新的物種被發現但樣品中微生物多樣性不會再增加。由此可見，本研究的測序深度足以滿足后續數據分析要求。本研究進一步對各梅干菜樣品特有及樣品間共有的OTU數及序列數進行分析，結果如圖2所示。

由圖2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中特有的OTU分別為2 442個、1 464個和3 565個，所包含序列數分別為3 982條、2 305條和9 698條。梅干菜樣品MGC01和MGC02共有OTU數為294個，梅干菜樣品MGC02和MGC03共有OTU數為315個，梅干菜樣品MGC01和MGC03共有OTU數為354個；3個梅干菜樣品共有OTU數為455個，其所包含的序列為61 568條，占總序列數的68.28%。由此可見，恩施地區梅干菜樣品中含有豐富的細菌物種且各樣品間存在大量共有細菌菌群。

圖1 稀疏曲線（A）和香農指數曲線（B）Fig.1 Rarefaction curves(A)and Shannon index curves(B)

圖2 梅干菜樣品OTU數及序列數的維恩圖Fig.2 Venn diagram of the OTU and sequence number in preserved vegetable samples

梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中所含細菌門的數量分別為13個、9個和10個，包含細菌屬的數量分別為186個、149個和148個，本研究將相對豐度＞1.0%的細菌門和屬定義為優勢細菌門和屬，并對其平均相對含量進行分析，結果如圖3所示。

圖3 梅干菜樣品中優勢細菌門（A）和屬（B）的相對含量分析Fig.3 Relative content analysis of dominant bacterial phyla(A)and genus(B)in preserved vegetable samples

由圖3可知，恩施地區梅干菜樣品中的優勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為60.70%、23.28%、11.16%、2.76%；優勢細菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium），其平均相對含量分別為60.50%、8.69%、2.86%、1.73%、1.28%、1.07%、1.03%和1.00%。值得一提的是，仍有7.40%的序列不能鑒定到屬水平，這進一步說明恩施地區梅干菜樣品中細菌多樣性較高。

2.2 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

在使用Illumina MiSeq高通量測序技術解析發現梅干菜中的細菌主要以乳酸菌為主的基礎上，本研究進一步采用傳統微生物學手段從3個梅干菜樣品中分離得到12株疑似乳酸菌，編號分別為MGC01-1、MGC01-2、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3、MGC02-4、MGC03-1、MGC03-2、MGC03-3和MGC03-4，疑似乳酸菌與其近源種模式株的系統發育樹如圖4所示。

由圖4可知，菌株MGC03-3、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3和MGC02-4與Lactobacillus plantarum NBRC 15891在同一個進化分枝上，親緣關系較近，故將其判定為植物乳桿菌（L.plantarum），同理，將菌株MGC03-1鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei），菌株MGC01-1鑒定為融合魏斯氏菌（Weissella confusa），菌株MGC03-2鑒定為食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），菌株MGC01-2和MGC03-4鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

圖4 梅干菜中乳酸菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in preserved vegetable samples

3 結論

本研究通過Illumina MiSeq高通量測序和傳統純培養技術對恩施地區梅干菜中細菌多樣性進行了解析，Illumina MiSeq高通量測序結果表明，恩施地區梅干菜樣品中的優勢細菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），優勢細菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。經稀釋涂布平板法從梅干菜樣品中共分離到12株乳酸菌，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）7株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）2株、副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）各1株。