白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡遷移的影響及機制

李雪玲，張凱敏,李孌英,李明君

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發病率僅次于乳腺癌，位居婦科惡性腫瘤第二位，而病死率位居首位。據統計，我國每年宮頸癌新增病例約30萬，死于宮頸癌的約5萬，而且宮頸癌的發病率逐年上升并有年輕化的趨勢[1-2]。宮頸癌的治療主要采用手術和放療，但針對早期病人有很好的效果，對于晚期病人，只能采取放療，而放療藥物有毒性作用，對病人身體會造成嚴重危害[3]。因此，尋找低毒高效的抗宮頸癌藥物受到廣大研究者的關注。中藥因作用廣譜，且能有效抑制腫瘤增殖，誘導細胞凋亡等作用成為研究熱點[4]。白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚化合物，存在于葡萄、藜蘆等植物中[5]。研究顯示，白藜蘆醇對腫瘤的起始、促進、進展三個過程均有明顯的抑制作用，并通過多種途徑對乳腺癌、肝癌等腫瘤有抑制效應[6-8]。p38絲裂原活性蛋白激酶(p38MAPKs)在多種腫瘤的生長和增殖中處于活性狀態，其特異性抑制劑SB203580對子宮內膜癌、食管癌等腫瘤有促凋亡和殺傷特性[9-10]。因此，本研究于2015年3月—2016年3月對白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡遷移的影響及機制進行探索，以期為后續更多研究治療宮頸癌的方法提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細胞 人宮頸癌HeLa細胞購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 試劑 胎牛血清(FBS)(批號：1618862)、RPMI1640培養基(批號：20131112)均購自美國Gibco公司；細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司(批號：B148216)；二喹啉甲酸(BCA)(批號：P0010S-1)、細胞計數試劑盒(CCK8)(批號：1213BS159)均購自碧云天生物技術有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)單克隆抗體購自美國Promeg(批號：101024)；B型白細胞/2型淋巴細胞樣蛋白(Bcl-2,批號：2772S)、Bcl-2相關X蛋白(Bax,批號：2762S)、單克隆抗體均購自美國CST公司；p38(批號：37619)、p-p38(批號：21771)抗體均購自Abcam公司；HRP標記的羊抗兔IgG(批號：109525)購自北京中杉金橋公司。

1.1.3 儀器 CO2細胞培養箱HERAcell型購自美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡CK2-TRC-3型購自日本Olympus公司；流式細胞儀LSR II購自美國BD公司；垂直電泳槽DYCZ-24EN購自北京六一儀器；128C型酶標儀購自奧地利CliniBio公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 從液氮罐中取出裝有人宮頸癌HeLa細胞的凍存管，37 ℃水浴解凍。向凍存管中加入含有10%FBS、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培養基，1 000 r/min離心5min，倒除上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種到細胞培養板中，37 ℃，5%CO2培養箱中培養。觀察到細胞融合度達到85%以上時，0.25%的胰酶消化細胞，顯微鏡下觀察細胞收縮趨于變圓時停止消化，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，離心，倒掉培養基，加入完全培養基培養，傳代。

1.2.2 CCK8檢測細胞增殖 取對數生長期的人宮頸癌HeLa細胞，胰酶消化細胞，調整細胞濃度為4×103/mL，將100 μL細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h。加入40、60、80、100 μmol/L的白藜蘆醇作用48 h，對照組不加白藜蘆醇。每孔加入含10%CCK8溶劑的培養液100 μL，培養箱中孵育4 h，酶標儀在波長為490 nm處測定并記錄各組的吸光度OD，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 白藜蘆醇與SB203580對宮頸癌細胞凋亡的影響 將細胞分為四組，即對照組(A組)：不做處理；SB203580組(B組)，加10 μmol/L SB203580；白藜蘆醇組(C組)，加60 μmol/L白藜蘆醇；白藜蘆醇組+SB203580組(D組)，加60 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L SB203580。將生長至對數期的人宮頸癌HeLa細胞以每毫升5×105個細胞接種于96孔細胞培養板中，37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h，觀察到細胞融合度達到70%～80%時，加入分組的四組細胞，37 ℃，5%CO2培養箱中培養48 h，收集懸浮及貼壁細胞，1 000 r/min離心5 min，膜聯蛋白V-FITC(AnnexinV-FITC)結合液重新懸浮細胞，避光室溫孵育10 min，離心，棄上清，碘化丙啶(PI)冰盒中避光孵育10 min。加400 μL緩沖液。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 白藜蘆醇與SB203580對宮頸癌細胞遷移的影響 取對數生長期的人宮頸癌HeLa細胞，調整細胞濃度為每毫升105個，Transwell小室上層加入100 μL細胞懸液，下層加入500 μL含10%FBS的RPMI1640培養基，培養24 h后，棄去上下室的培養基，上層分別加入四組細胞，下層加入含10%FBS的培養基，每個濃度設置3個重復孔，37℃，5%CO2濃度培養箱中培養24 h后，將培養基棄去，用棉簽輕輕拭掉膜上的細胞，HE染色后隨機選擇5個視野，顯微鏡下拍照計數。每組重復3次。

1.2.5 蛋白質印跡法(Western blot)檢測p38、p-p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達 四組細胞作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h后，PBS洗滌細胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，SDS-PAGE電泳分離，4 ℃轉膜過夜。取出PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別以p38、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax作為一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參用自動凝膠成像系統采集圖像并計算蛋白表達率。

2 結果

2.1白藜蘆醇對細胞增殖的影響為了確定白藜蘆醇作用于人宮頸癌HeLa細胞合適的濃度，選擇40、60、80、100 μmol/L的白藜蘆醇作用于細胞48 h，CCK8檢測細胞增殖活性。結果顯示，40、60、80、100 μmol/L白藜蘆醇的細胞抑制率分別為(24.1±2.3)%、(52.2±3.4)%、(73.1±3.1)%、(91.4±2.7)%，均顯著高于對照組(2.2±1.5)%，差異有統計學意義(P<0.05)，且表現出濃度依賴性。60 μmol/L的白藜蘆醇抑制了一半的細胞增殖，后續選擇60 μmol/L的白藜蘆醇作為研究對象。具體數據見表1。

表1 各組的 q′(Dunnett法) 雙側檢驗結果

注：與對照組相比，aP<0.05

圖1 白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡的影響

2.2白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡的影響四組細胞作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h后，B組細胞凋亡率顯著低于A組，差異有統計學意義(t=10.083，P=0.000)，C組和D組的凋亡率顯著高于A組，差異有統計學意義(t1=28.411，P1=0.000；t2=17.700，P2=0.000)，D組顯著高于B組,差異有統計學意義(t=7.617，P=0.000)，且低于C組，差異有統計學意義(t=10.710，P=0.000)，如圖1和表2。

表2 白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡的影響

注：與A組相比，aP<0.05;與D組相比，bP<0.05

2.3白藜蘆醇聯合SB203580對凋亡相關蛋白表達的影響四組細胞作用于人宮頸癌HeLa細胞48h后，Western blot檢測Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達，結果顯示，B組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著低于A組，差異有統計學意義(tCleaved-caspase3=13.276，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=3.345，PBax=0.010)，Bcl-2蛋白表達顯著高于A組，差異有統計學意義(tBcl-2=13.203，PBcl-2=0.000)；C組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著高于A組，差異有統計學意義(tCleaved-caspase3=29.791，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=25.948，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表達顯著低于A組，差異有統計學意義(tBcl-2=26.217，PBcl-2=0.000)；D組細胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著高于A組，差異有統計學意義(tCleaved-caspase3=19.861，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=12.658，PBax=0.000)，Bcl-2蛋白表達顯著低于A組(tBcl-2=18.143，PBcl-2=0.000)，差異有統計學意義(P<0.05)；D組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著高于B組，差異有統計學意義(tCleaved-caspase3=16.514，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=22.603，PBax=0.000)，低于C組tCleaved-caspase3=9.930，PCleaved-caspase3=0.000；tBax=13.291，PBax=0.000，Bcl-2蛋白表達顯著低于B組，差異有統計學意義(tBcl-2=13.013，PBcl-2=0.000)，高于C組，差異有統計學意義(tBcl-2=8.074，PBcl-2=0.000)，如圖2和表3。

圖2 白藜蘆醇聯合SB203580對宮頸癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

組別Cleaved-caspase3BaxBcl-2A組0.093±0.0090.154±0.0120.347±0.015B組0.162±0.011ab0.191±0.013ab0.208±0.014abC組0.315±0.013ab0.441±0.015ab0.071±0.010abD組0.223±0.012a0.294±0.014a0.156±0.012aF 值206.872269.831241.618P值0.0000.0000.000

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

2.4白藜蘆醇與SB203580對宮頸癌細胞遷移的影響四組細胞作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h后，B組細胞遷移數顯著高于A組，差異有統計學意義(t=9.495，P=0.000)，C組和D組細胞遷移數顯著低于A組，差異有統計學意義(t1=24.338，P1=0.000；t2=16.166，P2=0.000)，D組細胞遷移數顯著低于B組，差異有統計學意義(t=14.843，P=0.000)，高于C組，差異有統計學意義(t=8.171，P=0.000)，見表4。

表4 白藜蘆醇與SB203580對宮頸癌細胞遷移的影響

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

2.5白藜蘆醇與SB203580對p38和p-p38蛋白表達的影響四組細胞作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h后，Western blot檢測p38和p-p38蛋白表達，結果顯示，B組p-p38蛋白表達顯著低于A組，差異有統計學意義(t=5.636，P=0.001)，C組和D組細胞p-p38蛋白表達顯著高于A組，差異有統計學意義(t1=11.272，P1=0.000；t2=4.249，P2=0.003)，D組p-p38蛋白表達顯著高于B組，差異有統計學意義(t=16.909，P=0.000)，低于C組，差異有統計學意義(t=7.024，P=0.000)，p38在四組的蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3和表5。

圖3 白藜蘆醇與SB203580對宮頸癌HeLa細胞p38和p-p38蛋白表達的影響

3 討論

研究顯示，白藜蘆醇能抑制腫瘤細胞生長并通過殺傷腫瘤細胞達到抗腫瘤的目的，因此被認為是有效的潛在抗腫瘤藥物。

表5 白藜蘆醇與SB203580對p38和p-p38蛋白表達的影響

注：與A組相比，aP<0.05；與D組相比，bP<0.05

一些體外實驗顯示白藜蘆醇能通過影響細胞生長和炎癥、促進細胞凋亡、抗血管轉移等途徑抑癌和抗癌[11-12]。MAPKs信號通路對細胞增殖、凋亡、腫瘤轉移、蛋白合成等途徑有調控作用，p38是MAPK信號通路中重要的一員，p38MAPK信號通路能通過調節細胞增殖、凋亡、分化等維持機體各個組織的相對穩定。當p38MAPK信號通路受到抑制時，能引起細胞增殖[13-14]。本研究中用不同濃度的白藜蘆醇作用于人宮頸癌HeLa細胞，細胞增殖受到明顯的抑制，且隨著白藜蘆醇濃度增加細胞抑制率增加。60 μmol/L的白藜蘆醇抑制了一半的細胞增殖，被選擇作為后續研究對象。p38MAPK抑制劑SB203580與白藜蘆醇聯合處理細胞時，B組細胞凋亡率顯著低于A組，C組和D組細胞凋亡率顯著高于A組，D組細胞凋亡率顯著高于B組，低于C組。這說明白藜蘆醇通過p38MAPK抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

凋亡有內源性和外源性兩種途徑，雖然兩種途徑的機制不一樣，但都需要激活凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3，從而啟動細胞的程序性死亡[15]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在細胞凋亡過程中，Bax移位到線粒體膜上，導致膜電位發生變化，Bax空間構象變大從而發生活化。Bax發生活化后可誘導線粒體釋放細胞色素C，從而誘導細胞的凋亡。Bcl-2和Bax可結合形成二聚體，抑制或促進細胞的凋亡[16-18]。研究顯示，Bcl-2表達抑制和Bax表達升高，能使線粒體膜發生滲透性轉化，釋放細胞色素C，激活Cleaved-caspase3從而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，B組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著低于A組，Bcl-2蛋白表達顯著高于A組；C組和D組細胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著高于A組，Bcl-2蛋白表達顯著低于A組；D組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達顯著高于B組，低于C組，Bcl-2蛋白表達顯著低于B組，高于C組。

轉移是惡性腫瘤的基本特征之一，是對惡性腫瘤不斷增殖，并沿著趨化劑濃度梯度向遠處轉移的過程。其異常生長除了腫瘤本身的生長外，還能向腫瘤臨近組織侵襲并轉移到其他部位，這往往是腫瘤引起死亡的原因[19-20]。研究顯示，白藜蘆醇能通過多種機制抑制腫瘤細胞的遷移[21]。本研究結果顯示，白藜蘆醇能抑制宮頸癌細胞的遷移，p38MAPK抑制劑能減弱白藜蘆醇對細胞遷移的影響。這說明白藜蘆醇通過調控p38MAPK信號通路抑制宮頸癌細胞遷移。

綜上所述，白藜蘆醇可通過調控p38MAPK信號通路抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖和遷移，并通過調節caspase3、Bax、Bcl-2促進細胞凋亡。