血清Th1/Th2型細(xì)胞因子在乙肝感染不同時(shí)期的表達(dá)及其臨床意義*

沈軼驪,喻霞云,豐 斌,黃祖興，王 琳△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心,江蘇蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)，江蘇蘇州 215000)

乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)感染是一類(lèi)發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜的疾病，目前認(rèn)為，細(xì)胞免疫在乙肝疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[1]。輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同分為T(mén)h1、Th2 2個(gè)亞群，Th1/Th2平衡在維持機(jī)體免疫功能中起著重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生HBV慢性感染時(shí)，會(huì)出現(xiàn)“Th1/Th2平衡漂移”的現(xiàn)象。因此，本研究運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)HBV感染患者血清中Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，探討乙肝患者細(xì)胞免疫狀態(tài)(Th1/Th2)和乙肝慢性化之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年10月至2013年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染病科收治的102例HBV感染者，其中女28例、男74例，平均年齡(49.68±15.41)歲。將102例HBV感染患者分為3組：(1)慢性乙型肝炎(CHB)組：共42例，其中女10例、男32例，平均年齡(39.38±14.31)歲。(2)肝硬化(LC)組：共30例，其中女12例、男18例，平均年齡(56.18±11.90)歲。(3)原發(fā)性肝癌(HCC)組：共30例，其中女6例、男24例，平均年齡(55.38±13.42)歲。根據(jù)2010年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，所有患者均乙肝表面抗原陽(yáng)性，并剔除丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、艾滋病病毒(HIV)等重疊感染以及其他原因引起的肝臟損害。(4)健康對(duì)照組(NC)：共30例，其中女15例、男15例，平均年齡(43.51±8.53)歲，健康對(duì)照組收集于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康管理中心，無(wú)肝炎病史且乙肝標(biāo)志物測(cè)定均為陰性。

1.2儀器與試劑 Bio-Rad 680酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司；白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioLegend公司。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)方法 采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中IL-4、IL-6和IFN-γ水平。操作步驟按照美國(guó)BioLegend公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2結(jié)果計(jì)算 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)，水平為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=aX+b。測(cè)定樣品的OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到其水平。

2 結(jié) 果

2.1一般資料分析 由表1可知HBV感染者中，CHB、LC、HCC組患者的年齡、性別2個(gè)基本臨床資料差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與乙肝相關(guān)的HBeAg陽(yáng)性率、ALT水平及HBV DNA載量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 HBV感染不同階段的一般資料分析或M(P25～P75)]

2.2HBV慢性化患者血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果分析 由表2、圖1～4可知，IFN-γ、IL-4、IL-6水平在各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.62、58.63、47.29，P<0.01)。經(jīng)兩兩相互比較可知，IFN-γ、IL-4、IL-6水平在CHB、LC和HCC組均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-4水平在CHB組高于LC組和HCC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-6水平在HCC組高于CHB組和LC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比，IFN-γ/IL-4的比值在CHB組、LC組和HCC組都明顯減小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.63，P<0.05)。

表2 HBV感染不同時(shí)期患者血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果分析[M(P25～P75)]

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01； LC組與HCC組IL-4表達(dá)水平與CHB組比較，cP<0.01； CHB組、LC組IL-6表達(dá)水平與HCC組比較，dP<0.01

圖1 CHB、LC、HCC組與健康對(duì)照組IFN-γ水平比較

圖2 CHB、LC、HCC組與健康對(duì)照組IL-4水平比較

圖3 CHB、LC、HCC組與健康對(duì)照組IL-6水平比較

2.3細(xì)胞因子表達(dá)量與HBV DNA載量、ALT和HBeAg相關(guān)性分析 HBV慢性化患者血清中IFN-γ水平與HBV DNA的載量、ALT呈不同水平程度的負(fù)相關(guān)(r=-0.786、-0.713,P<0.001)(圖5～7)；IL-4水平與HBV DNA載量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.757,P<0.001)(圖8)；而IFN-γ、IL-4、IL-6在慢性乙肝患者外周血清中的水平與HBeAg沒(méi)有顯著的相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

圖4 CHB、LC、HCC組與健康對(duì)照組Th1/Th2比較表3 不同階段HBV感染患者血清中細(xì)胞因子水平與HBeAg相關(guān)性分析[M(P25～P75)]

HBeAgnIFN-γ(ng/mL)IL-4(pg/mL)IL-6(ng/mL)陽(yáng)性362.06(1.03～3.64)90.75(66.65～120.20)3.45(1.94～5.78)陰性662.06(1.19～3.32)90.99(54.54～120.38)3.46(1.86～8.69)U-1 149.501 065.501 128.00P->0.05>0.05>0.05

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)

圖6 IFN-γ水平與HBV DNA載量相關(guān)性分析

圖7 IFN-γ水平與ALT水平相關(guān)性分析

圖8 IL-4水平與HBV DNA載量相關(guān)性分析

3 討 論

HBV的感染，從攜帶HBsAg抗原發(fā)展為CHB、LC,最后演變?yōu)镠CC是個(gè)長(zhǎng)期的持續(xù)過(guò)程[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞功能的失衡可能會(huì)使HBV感染轉(zhuǎn)為慢性化[5]。當(dāng)Th1細(xì)胞占主導(dǎo)時(shí)，機(jī)體清除HBV病毒，使其恢復(fù)；而當(dāng)Th2細(xì)胞占主導(dǎo)時(shí)，機(jī)體處于慢性持續(xù)感染狀態(tài)[6]。最近有研究者對(duì)HBV感染后處于免疫耐受、免疫清除及急性期乙型肝炎分析發(fā)現(xiàn),患者體內(nèi)的細(xì)胞因子水平及Th1/Th2比率都發(fā)生了明顯的改變，與健康對(duì)照組比較，乙肝患者Th1/Th2比率顯著升高，但在以上3個(gè)疾病階段未發(fā)現(xiàn)明顯差異[7]。為進(jìn)一步了解HBV感染患者T細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，在本課題組之前對(duì)乙肝患者T細(xì)胞表面相關(guān)免疫分子的研究基礎(chǔ)上[8-9]，筆者主要研究了在HBV感染的不同階段，患者外周血細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-6)的表達(dá)水平，進(jìn)一步探其T細(xì)胞免疫狀態(tài)與乙型肝炎病毒感染慢性化兩者的相關(guān)性。

IFN-γ和IL-4在HBV患者血清中的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，但I(xiàn)FN-γ/IL-4比值明顯低于健康對(duì)照組,這與施文娟等[6]發(fā)現(xiàn)CHB患者血清中IFN-γ水平顯著升高相一致。筆者對(duì)CHB、LC和HCC組還進(jìn)行了兩兩相互比較，結(jié)果顯示，IL-4水平在CHB組高于LC組和HCC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IFN-γ的水平在CHB、LC和HCC組未見(jiàn)顯著變化。推測(cè)機(jī)體感染乙肝病毒后，激活Th細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子。與分泌Th1型細(xì)胞因子相比，Th細(xì)胞分泌了更多Th2型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫平衡向Th2方向傾斜，機(jī)體表現(xiàn)為HBV感染慢性化。根據(jù)研究，筆者還發(fā)現(xiàn)IL-6水平在HCC組高于CHB組和LC組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。已有研究者報(bào)道乙肝病毒感染相關(guān)肝癌的進(jìn)展中，IL-6和TNF-α水平會(huì)顯著升高[10]。感染乙肝病毒后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到刺激，免疫細(xì)胞激活后會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-6等炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子會(huì)介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致肝纖維化[11]。

同時(shí)筆者將乙肝病毒感染患者血清中IFN-γ、IL-4、IL-6水平與HBV DNA載量、HBeAg和ALT等檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的表達(dá)水平與HBV DNA的載量、ALT呈不同水平程度的負(fù)相關(guān)；IL-4的表達(dá)水平與HBV DNA載量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HBV DNA載量可衡量乙肝病毒持續(xù)存在，且在乙肝慢性化進(jìn)程中呈現(xiàn)出顯著差異，HBV DNA載量在CHB患者、LC患者、HCC患者中逐漸較少。據(jù)此筆者推測(cè)IFN-γ和IL-4水平與乙肝病毒感染相關(guān)。ALT的水平可篩選肝臟疾病[12]，ALT水平在乙肝慢性化的進(jìn)展過(guò)程中，呈現(xiàn)出顯著差異，這提示IFN-γ可能與乙肝病毒感染相關(guān)，由此筆者推測(cè)IFN-γ可作為監(jiān)測(cè)乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能的新指標(biāo)。

通過(guò)對(duì)HBeAg陽(yáng)性和陰性分組研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、IL-4和IL-6在血清中的表達(dá)沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但研究表明，在乙肝病毒感染不同階段，HBeAg陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBeAg可用于篩選肝臟疾病。需要指出的是，筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，年齡及性別在HBV感染不同時(shí)期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與多數(shù)學(xué)者認(rèn)為兩者在乙肝不同時(shí)期無(wú)差異不一致[13]。考慮原因是收集不同感染時(shí)期的標(biāo)本數(shù)量較少，導(dǎo)致結(jié)果有差異，后期將繼續(xù)擴(kuò)大標(biāo)本量研究。

4 結(jié) 論

IFN-γ與IL-4水平比例失衡可能與患者乙肝病毒持續(xù)感染有關(guān)，導(dǎo)致乙肝病毒無(wú)法清除。提示IFN-γ可作為新的監(jiān)測(cè)指標(biāo)與HBV DNA載量、ALT和HbeAg共同反映HBV感染不同階段患者T細(xì)胞的免疫功能，這可以為進(jìn)一步研究乙肝患者免疫功能提供線索，為臨床治療和預(yù)后判斷帶來(lái)福音。