α-突觸核蛋白通過抑制Wnt/β-catenin信號通路參與帕金森病發病機制

程麗萍， 王 浩， 車峰遠， 亓法英

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的以運動障礙為特征的中樞神經系統退行性疾病，其典型病理特征為α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)異常聚集后細胞內包涵體Lewy小體的形成[1]。Wnt/β-catenin信號通路在神經發生、神經元存活、軸突延長中發揮重要作用，并參與癌癥、糖尿病及神經退行性疾病等疾病的發生，研究提示在PD患者中樞神經系統中Wnt/β-catenin信號通路受到抑制[2～5]，近年來有證據顯示α-synuclein異常聚集可能對Wnt/β-catenin信號產生影響[6]，但是其具體機制不明。本實驗以C57BL/6小鼠和人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)為模型，探討中腦組織中α-synuclein異常集聚對Wnt/β-catenin信號通路的相關影響及其可能的分子機制，為PD的發病機制研究及干預策略提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及處理 8 w齡雄性C57BL/6小鼠30只，體重23～27 g隨機分為正常對照組和MPTP損傷組，每組15只。α-syn轉基因小鼠15只，購買于美國Jackson實驗室。MPTP損傷組小鼠腹腔注射MPTP(20 mg/kg)，每周1次，連續注射3 w。正常對照組經相同方式給予相同體積的生理鹽水。將動物圈養在(23±1) ℃的環境溫度和(60±10)%相對濕度12 h光照/黑暗周期下并允許水和自由獲取食物。

1.1.2 細胞培養、轉染和處理 SH-SY5Y細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC，USA)。細胞培養液DMEM(GIBCO實驗室，USA)，含10%FBS(Gibco公司實驗室，USA)，100 U/ml青霉素(GIBCO實驗室，USA)和100 mg/ml鏈霉素(Sigma-Aldrich公司生物技術，USA)。培養物保持在37 ℃，5%CO2和95%空氣的潮濕環境中。待細胞在35 mm培養皿內80%匯片時，采用lipofectAMINETM按照實際說明書進行轉染。用不含FBS的DMEM洗滌細胞兩次，用1 ml含有10 μ l lipofectAMINETM和2 μg質粒DNA的OPTI-MEM孵育細胞5 h，洗滌，改用含10%FBS的DMEM繼續培養48 h，實驗前將細胞接種于6孔板，在含10%胎牛血清的DMEM中培養24 h，然后用含或載體的無血清培養基代替培養基。2 h后，將MPP+(1 mmol/L，購自Sigma公司)或阿立哌唑(50 nM，Sigma-Aldrich Biotechnology，USA)加入到培養基中24 h。

1.2 方法

1.2.1 免疫印跡法(Western boltting)測定小鼠中腦組織中蛋白表達 取α-syn過表達轉基因小鼠及正常小鼠、MPTP損傷小鼠的中腦組織，用預冷的PBS 漂洗細胞2次，置于冰上，每孔加入150 μl 細胞裂解液(SDS 2 g、Tris堿0.7571 g、溴酚藍0.01 g、DTT 0.771 g、去離子水90 ml、甘油10 ml) 裂解20 min，超聲，4 ℃、1400 r /min 離心10 min，沸水煮5 min，冷卻。根據生產商的說明書(Beyotime Institute of Biotechnology，China)使用二辛可寧酸(BCA)法測定樣品中蛋白質的含量，并在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離。將40 μg蛋白質轉移到硝酸纖維素濾膜上并用5%脫脂牛奶封閉2 h。然后將膜與一抗(抗T-GSK-3β，抗p-GSK-3β，抗α-syn)在4 ℃過夜并用1×Tris-緩沖鹽水/吐溫20(TBST)洗滌10 min 3次。然后將膜與1∶5000稀釋度的相應的HRP偶聯的第二抗體溫育1 h，并用1×TBST洗滌3 min 10 min。在Bio-Rad中觀察膜并通過ImageLab軟件分析圖像。使用β-actin作為內部對照。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞中α-突觸核蛋白和p-GSK-3β蛋白表達 SH-SY5Y細胞分為3組：對照組、α-syn過表達組(過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)、MPP+損傷組(MPP+干預的SH-SY5Y細胞)。制備單細胞懸液1 ml(含1×106細胞)，冷PBS洗滌1次，100 μl PBS懸浮細胞，分別向其中加入抗α-syn抗體10 μl、抗p-GSK-3β抗體10 μl，室溫避光放置30 min，之后加入相應熒光二抗室溫孵育60 min后進行流式細胞術檢測。

1.2.3 Western boltting檢測細胞中蛋白表達 SH-SY5Y細胞分為4組：對照組、α-syn過表達組(過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)、MPP+損傷組(MPP+干預的SH-SY5Y細胞)、阿立哌唑預處理組(經阿立哌唑干預的過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)。根據生產商的說明書(Beyotime Institute of Biotechnology，China)使用二辛可寧酸(BCA)法測定樣品中蛋白質的含量，并在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離。將40 μg蛋白質轉移到硝酸纖維素濾膜上并用5%脫脂牛奶封閉2 h。然后將膜與一抗(抗T-GSK-3β，抗p-GSK-3β，抗α-syn)在4 ℃過夜并用1×Tris-緩沖鹽水/吐溫20(TBST)洗滌10 min 3次。然后將膜與1：5000稀釋度的相應的HRP偶聯的第二抗體溫育1 h，并用1×TBST洗滌10 min 3次。在Bio-Rad中觀察膜并通過ImageLab軟件分析圖像。使用β-actin作為內部對照。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)測定細胞活性 SH-SY5Y細胞分為4組：對照組、α-syn過表達組(過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)、MPP+損傷組(MPP+干預的SH-SY5Y細胞)、阿立哌唑預處理組(經阿立哌唑干預的過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)。置于37 ℃和5%CO2環境下孵育24 h，加入96孔板中，并加入150 μl，0.5 mg/ml的MTT(Sigma-Aldrich公司生物技術，USA)，將細胞維持在37 ℃，5%CO2和95%空氣的環境中。在450 nm波長處檢測到每個孔的吸光度H。隨后，除去細胞上清液，然后200 ℃溫浴。

1.2.5 Hoechst 33342/PI雙染法檢測細胞凋亡 SH-SY5Y細胞分為3組：對照組、α-syn過表達組(過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)、阿立哌唑預處理組(經阿立哌唑干預的過表達α-syn的SH-SY5Y細胞)。SH-SY5Y細胞(105個細胞/孔)置于24孔板上的蓋玻片上生長。在室溫黑暗中用Hoechst 33342/PI[10μg/(ml·孔)]染色10 min。進行流式分析檢測。

1.2.6 免疫熒光雙標染色 將α-syn轉染細胞接種在無菌蓋玻片上。貼壁后，將它們在室溫下在4%多聚甲醛中孵育15 min。將固定的細胞用含有0.1% Triton X-100的0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透化20 min，然后用10%山羊血清在室溫下封閉1 h。封閉后，將細胞在4 ℃與用抗α-syn(1∶500稀釋，Bioworld Technology，USA)、抗GSK-3β(1∶600稀釋，Millipore，USA)一起孵育過夜。用0.01 M PBS將細胞洗滌3次5 min。與Alexa Fluor 555綴合的山羊抗小鼠抗體(CST，USA)和異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯的山羊抗兔抗體(Jackson ImmunoResearch，Inc，West Grove，PA，USA)作為二抗，稀釋倍數為1：1000，室溫孵育2 h。在共聚焦激光掃描顯微鏡LEICA TCS SP5 MP(Leica，Heidelberg，德國)下檢查細胞之前，細胞核用4’B，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，CST，USA)在室溫下染色45 s。

2 結 果

2.1 α-synuclein轉基因小鼠模型中α-synuclein過表達上調p-GSK-3β的表達水平 正常小鼠與MPTP損傷模型組小鼠中腦組織中α-synuclein表達無明顯差異(P>0.05)，α-syn轉基因小鼠組中腦組織中α-synuclein表達量較對照組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。T-GSK-3β3組表達無顯著差異(P>0.05)，α-syn轉基因小鼠中腦組織中p-GSK-3β蛋白水平上調，α-syn的過表達與p-GSK-3β上調具有相關性，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示α-syn的過表達可能誘導了p-GSK-3β上調(見圖1)。

2.2 α-synuclein過表達SH-SY5Y細胞模型中α-synuclein顯著上調p-GSK-3β水平 在以上結果基礎之上，我們進一步在細胞水平進行相關實驗，應用α-syn過表達SH-SY5Y細胞作為模型進行相關檢測，流式細胞術結果提示：α-syn過表達SH-SY5Y細胞中α-synuclein表達量明顯增高，與正常對照組及MPP+損傷組相比，α-syn過表達組中p-GSK-3β蛋白水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，提示α-syn的過表達可能誘導了p-GSK-3β上調(見圖2)。

MPP+損傷組與正常組相比(P>0.05)；α-syn轉基因組與正常組、MPP+損傷組相比(P<0.05)。與對照組相比

2.3 阿立哌唑可以抑制α-synuclein誘導的p-GSK-3β上調 本實驗同時引入Wnt/β-catenin信號通路激動劑進行相關檢測，MPP+損傷組細胞與正常對照組細胞α-synuclein和p-GSK-3β表達量無明顯差異，與以上兩組細胞相比，α-syn過表達組細胞中α-synuclein表達明顯增高(P<0.05)，T-GSK-3β無明顯差異，而p-GSK-3β表達增加，與正常對照組及MPP+處理組相比具有統計學差異(P<0.05)。阿立哌唑預處理組α-synuclein表達仍較正常組明顯升高(P<0.05)，與α-syn過表達組無明顯差異，而p-GSK-3β表達下降，與α-syn過表達組具有統計學差異，提示α-syn的過表達可能誘導了p-GSK-3β上調，而阿立哌唑可以顯著緩解α-syn的過表達誘導的p-GSK-3β上調(見圖3)。

MPP+損傷組與正常組相比(P>0.05)；α-syn轉基因組與正常組、MPP+損傷組相比(P<0.05)；A+α-syn與α-syn轉基因組相比(P<0.05)；A：阿立哌唑。與對照組比較

2.4 阿立哌唑可以緩解α-synuclein誘導的細胞活性降低 采用MTT方法對細胞活力進行相關檢測，結果提示：與對照組細胞相比，MPP+損傷組細胞活性明顯降低，α-syn過表達組細胞活性亦顯著降低，而阿立哌唑預處理組細胞活性高于α-syn轉基因組，提示α-syn的過表達可以導致細胞活性降低，而阿立哌唑可以抵抗α-syn的過表達所誘導的細胞損傷(見圖4)。

α-syn轉基因組與正常組、MPP+損傷組相比(P<0.05)；A+α-syn與α-syn轉基因組相比(P<0.05)；A：阿立哌唑。與對照組相比

2.5 阿立哌唑可以緩解α-synuclein誘導的細胞凋亡 采用Hoechest 33342/PI雙染法對各組細胞凋亡率進行檢測，結果提示：與對照組細胞相比，MPP+處理組細胞活性明顯降低，α-syn過表達組細胞活性亦顯著降低，而阿立哌唑預處理組細胞活性高于α-syn轉基因組，提示α-syn的過表達誘導細胞凋亡，而阿立哌唑可以抵抗α-syn的過表達所誘導的細胞凋亡(見圖5)。

α-syn轉基因組與正常組相比(P<0.05)；A+α-syn與α-syn轉基因組相比(P<0.05)；A：阿立哌唑。與對照組比較

2.6 α-synuclein與GSK-3β可能存在共定位關系 最后我們采用激光共聚焦顯微鏡進行相關檢測以明確α-synuclein與GSK-3β可能存在的共定位關系，結果顯示α-synuclein及p-GSK-3β的相應的熒光信號存在共定位關系，提示α-synuclein可能通過抑制wnt/β-catenin信號通路關鍵分子GSK-3β的活性而發揮作用(見圖6)。

圖6 激光共聚焦顯微鏡檢測，α-synuclein與GSK-3β可能存在共定位關系

3 討 論

帕金森病是臨床常見的中樞神經系統退行性疾病，研究提示α-synuclein的異常聚集是導致其發病的關鍵分子，異常聚集的α-synuclein可以誘導中腦多巴胺能神經元的凋亡增加并導致臨床發病[7]，研究表明，Wnt/β-catenin信號通路作為一種信號級聯反應在神經系統的生長、分化和發育中發揮了重要作用，該信號通路的過度活化或抑制參與多種疾病的發生和發展。在中樞神經系統退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)中，發現AD患者的PS1突變能夠導致GSK-3β水平增加及β-catenin水平降低，Wnt/β-catenin信號通路失活[8，9]。Wnt共受體LRP6的剪接變體人LRP6Δ3也能夠抑制Wnt/β-catenin信號傳導，增加患AD的風險。相反，在SH-SY5Y細胞中Wnt共受體(LRP5 / LRP6)過表達可導致經典Wnt信號通路異常活化，從而保護神經元抵抗氧化應激損傷，并通過減少GSK-3β介導的Tau過度磷酸化促進神經元存活[10]。Sancho等[11]報道稱，正常情況下，LRRK2能與Wnt家族成員相互作用，特別是Dishevelled蛋白(Dvl-1，Dvl-2和Dvl-3)。LRKK2作為支架蛋白連接經典Wnt信號通路膜組分與胞質組分，例如LRP6的細胞內結構域與Dvl蛋白連接，Dvl蛋白再與β-catenin破壞復合物相結合，從而促進經典Wnt信號通路的活化。相反，Roc，COR和激酶結構域中的LRRK2突變能夠降低LRRK2-LRP6親和力，從而抑制經典Wnt信號通路活性，導致神經變性增加[12]。以上研究均提示Wnt/β-catenin信號通路可能參與了中樞神經系統退行性疾病的發病機制，有證據表明α-synuclein可以抑制Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子NFAT和CREB的轉錄激活[6]，提示α-synuclein可以影響Wnt/β-catenin信號通路，因此在帕金森病中α-synuclein是否可以也可以通過抑制Wnt信號通路從而干擾神經細胞的增值和自我修復值得我們做進一步研究。

我們的研究發現，在α-syn轉基因小鼠中腦系統中，α-syn的表達增加與p-GSK-3β的上調相關，而應用過表達α-syn的SH-SY5Y細胞進行相關實驗得到了相同的實驗結果，提示α-syn的過表達與Wnt/β-catenin信號通路的相應變化存在相關關系。GSK-3β是一種重要的Wnt信號通路調控因子，它作為一種特異性神經元內絲氨酸-蘇氨酸激酶，參與調節多種病理生理過程，如細胞膜信號傳導、神經元極性分化、細胞凋亡和炎癥反應。在Wnt/β-catenin信號通路中，GSK-3β對β-catenin具有抑制作用，破壞β-catenin蛋白在細胞質中的穩定性并抑制其向細胞核遷移，從而抑制經典Wnt信號通路的活性[5]。我們的結果提示，α-syn的過表達可能通過干擾GSK-3β的酶解活力從而間接影響β-catenin的蛋白水平，降低Wnt/β-catenin信號通路活性，而MTT法和流式細胞術分析結果也提示細胞活性的改變與Wnt/β-catenin信號通路存在對應關系，其中GSK-3β的磷酸化水平可能發揮了重要的調節作用。MPP+是一種常用的PD細胞模型誘導藥物[13]，為了與MPTP損傷動物型對應，本研究應用MPP+作為細胞損傷劑，結果提示單純MPP+處理α-synuclein表達未見明顯升高，同時對于GSK-3β的活力也沒有明顯的影響，而在α-syn過表達組發現細胞內p-GSK-3β的水平上調，提示其活力下降，而Wnt/β-catenin信號通路激動劑阿立哌唑[14]可以抑制α-syn過表達誘導的p-GSK-3β的水平上調，即α-syn過表達可以抑制Wnt/β-catenin信號通路，而MPP+處理沒有此作用，提示Wnt/β-catenin信號通路的干擾是由α-syn過表達誘發的。

在以上實驗基礎之上，我們進一步采用了激光共聚焦顯微鏡分析了α-synuclein與GSK-3β的相關關系，結果提示二者存在共定位，進一步提示α-syn可能通過作用于Wnt/β-catenin信號通路而發揮作用，但是其作用是直接還是間接目前并不清楚，α-synuclein對GSK-3β活性的影響是否通過其他通路實現并不清楚，相關研究已經證實，α-synuclein異常聚集可以對Parkin蛋白的活性產生影響，而早在2009年就有研究表明Parkin可以直接作用于Wnt/β-catenin信號通路發揮保護作用[15]，α-synuclein異常聚集是否可以通過對Parkin蛋白發揮作用從而間接的對Wnt/β-catenin信號通路產生影響目前也未可知，同時有研究顯示PPA的活動作用參與了α-synuclein所誘導的Wnt/β-catenin信號通路活動變化。其最終信號分子的水平與PPA的活性相關，PPA可以通過調節GSK-3β的磷酸化水平發揮其調控作用，而大量研究已經證實了α-synuclein可以作用于PPA而抑制其磷酸化的能力[16，17]，因此我們的研究提示了α-synuclein與GSK-3β的可能相關關系，但其具體的關聯作用需要進一步研究探討。同時β-catenin是GSK-3β的作用底物，Wnt/β-catenin信號通路最終通過β-catenin水平變化發揮作用，本研究的進一步方向將對β-catenin蛋白水平進行相應檢測從而進一步明確α-synuclein與Wnt/β-catenin信號通路的整體關系，為進一步了解PD的中腦發病機制開闊研究思路。總之，我們的研究提示了α-synuclein可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路導致神經元損傷，從而參與帕金森病的發病機制。但是其具體機制需要進一步進行相關研究，以期為帕金森病的發病機制探討提供思路。