CLU基因多態性與新疆哈薩克族及漢族阿爾茨海默病的相關性研究

張玉潔， 陸 潔， 孟新玲， 許奔奔， 徐 夢， 張 燕

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進行性記憶及認知障礙為主要表現的中樞神經系統退行性疾病，占所有癡呆患者的60%～80%[1，2]。眾所周知，遺傳因素及環境因素均參與了AD的發病，不同種族及不同地區人群AD的發生率不同，本課題組前期對新疆阿勒泰地區流行病學調查，調研發現該地區55歲以上哈薩克族居民AD患病率明顯高于當地漢族AD患病率，且高于全國水平，其患病率隨著年齡急劇增長，尤其是80歲以上人群AD患病率高達30.28%[3]。

近年全基因組關聯研究(Genome wide association studies，GWAS)發現了很多新的晚發型AD(1ateonset Alzheimefs disease，LOAD)可能的風險基因，亦發現聚集素(clusterin，CLU)中CLU基因的多態性與AD風險相關[4，5]。CLU作為細胞外伴侶，與Aβ1-40寡聚體相互作用，并能夠通過封存影響其聚集和分解，研究CLU基因多態性，可能掌握重要的線索來闡明與AD發病的有關的機制。不同種族進行了多項驗證研究，目前其研究結果并不一致。新疆哈薩克族是游牧民族，有自身特殊的地域環境因素、生活方式和民族習俗，遺傳背景有差異性。目前有關新疆哈薩克族AD基因方面研究較少，本研究采用病例對照方法探討CLU基因rs11136000 位點及rs9331888位點多態性與新疆哈薩克族SAD的相關性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 收集來自全疆各地2016年1月～2018年2月在新疆醫科大學附屬中醫醫院神經退行性疾病臨床大數據庫的AD患者共118例，均為散發性；其中哈薩克族58例，漢族60例，男性75例，女性43例，年齡在49～91歲之間，平均(74.6±7.85)歲，選擇與病例組相匹配的年齡、性別、地域環境因素、生活方式和民族習俗，并無血緣關系的非AD患者或健康志愿者作為對照組，共139例，其中哈薩克族79例，漢族60例，男性75例，女性64例，年齡在58～81歲之間，平均(72.7±6.21)歲。所有被研究對象均需在知情同意書上簽字。按照新疆醫科大學附屬中醫醫院倫理委員會制定的倫理學的標準進行審核。

納入標準：(1)患者均主要表現記憶力障礙，癥狀持續時間≥6 m，癡呆診斷標準采用美國精神病學會制定的DSM-IV。經全套神經精神量表進行癡呆篩查，且符合2011年美國國家衰老研究所和阿爾茨海默病學會(NIA-AA)標準制定的“很可能AD癡呆”的核心臨床診斷標準。(2)改良HACHINSDI缺血評分(Hachinski ikschemic sacle，HIS)<4分，MRI排除血管性癡呆(VD)和其他可導致癡呆的神經系統疾病。(3)漢密爾頓抑郁量表(HAMD)24項版評分<17分，排除抑郁癥。排除標準：由創傷、中毒、腫瘤、甲狀腺功能減退癥、維生素缺乏癥、帕金森病、血管性癡呆及其他腦器質性疾病引起的各種癡呆。所有患者的確診由兩名神經內科副主任醫師獨立完成，所有的研究對象在納入前均簽署知情同意書，本研究通過新疆自治區中醫醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 收集空腹靜脈血5 ml并置于-80 ℃冰箱中，分批進行DNA的提取。

1.2.2 KASP技術及DNA測序檢測CLU基因位點多態性 研究中的SNP基因座信息來自公共數據庫NCBI GeneBank數據庫，查詢基因CLU標準序列(httP// www. ncbi. nlm. nih. Gov/ Gene bank/GenebankOveriew. hlm)。其序列號為rs11136000 及rs9331888位點。采用Primer Premier 3.o軟件設計SNPrs11136000 及rs9331888位點的KASP引物httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/)，rs11136000位點Primer_Allele FAM引物序列為5’-CTCAAACTCCTGACCCCAAG-3’，Primer_Allele HEX引物序列為5’-CTATTGCAACCATGCCTCCT-3’。rs9331888位點Primer_Allele HEX引物序列為5’-ATGCAACAGCCTCAGCTTCT-3’，Primer_Allele HEX引物序列為5’-AGGCTTCCCAGAGAAAGTCC-3’。PCR產物用LGC公司的KASP Master Mix V3.0進行反應，PCR反應程序結束后將樣本置于ABI Q6中檢測FAM及HEX熒光信號，收集熒光信號，儀器根據每個樣本檢測的熒光信號值自動分型Homozygous為純合子，Heterozygous為雜合子。隨機挑選樣本進行直接測序驗證KASP分型結果，將大小正確的PCR產物切膠回收后送新疆昆泰瑞生物技術有限公司測序。

1.3 統計學分析 采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，采用基因計數法描述SAD及對照組基因頻率和基因型分布；其計數資料以例數和率(%)表示，SAD及對照組之間比較采用χ2檢驗和Firsher精確概率法，計算優勢比(OR)及其95%置信區間(CI)表示相對風險；數據使用SPSS 22.0進行處理。借助HaPloview 4.2軟件進行連鎖不平衡(1inkage disequilibrium，LD)分析和單體型(haPlotyPe)分析。所有統計學檢驗均為雙側概率檢驗，檢驗水準以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 本研究對AD組和對照組的性別、年齡、吸煙史等相關影響因素等進行比較，結果顯示兩組一般資料之間均無明顯差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

2.2 Hardy-weinberg平衡定律吻合度檢驗 漢族及哈薩克族病例組與及對照組CLU基因rs11136000、rs9331888基因型分布均符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，吻合度良好。

2.3 基因多態位點檢測結果 電泳圖、測序圖、KASP分型圖結果：CLU基因rs11136000、rs9331888位點，為檢測基因濃度及純度，電泳結果見圖1、3，經測序峰圖分析見圖2、4，KASP分型(見圖5、圖6)。

2.4 漢、哈SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系

2.4.1 新疆SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 整體SAD組CLU基因rs11136000 多態位點T等位基因頻率明顯低于對照組(15.7% VS 25.2%，χ2=6.991，P=0.008)，攜帶T等位基因患AD風險比攜帶G等位基因者低44.8%(OR=0.552，95%CI=0.355～0.762，P=0.008)，SAD組TT基因型頻率也明顯低于對照組(1.7% VS 7.9%，χ2=7.991，P=0.018)，SAD組攜帶TT基因型頻率患AD風險比攜帶GG基因型者低82.5%(OR=0.175，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)，TG基因型患AD風險比攜帶GG基因型者低33.7%(OR=0.663，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)，Logistic校正年齡、性別的影響后，發現攜帶T等位基因者(TT+TG基因型)患AD風險比攜帶GG基因型者低42.8%(OR=0.572，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)(見表2)。

2.4.2 哈族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 新疆哈族SAD組CLU基因rs11136000 多態位點T等位基因頻率明顯低于對照組(12.9% VS 27.8%，χ2=8.809，P=0.003)，SAD組TT基因型頻率也明顯低于對照組(1.7% VS 8.9%，χ2=8.242，P=0.016)，Logistic校正年齡、性別的影響后，發現攜帶T等位基因者(TT+TG基因型)患AD風險比攜帶GG基因型者低63.9%(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)，TG基因型患AD風險比攜帶GG基因型者低58.6%(OR=0.414，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)(見表3)。

2.4.3 漢族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD

的關系 SAD與對照組CLU rs11136000 位點等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)頻率(T：18.3% vs 21.7%，G：81.7% vs 78.3%，TT：1.7% vs 6.7% TG：33.3% vs 30.0%，GG：65.0% vs 63.3%)比較，均差異無統計學意義(χ2=0.417，P=0.51，χ2=1.782，P=0.516)(見表4)。

2.4.4 漢族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 SAD與對照組CLU rs11136000 位點等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)頻率(T：18.3% vs 12.9%，G：81.7% vs 87.1%，TT：1.7% vs 1.7%，GG：65.0% vs 75.9%，TG：33.3% vs 22.4%)比較，均差異無統計學意義(χ2=1.302，P=0.254；χ2=1.753，P=0.416)(見表5)。

2.5 CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系

2.5.1 新疆SAD組及對照組CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統計學意義(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表6)。

2.5.2 新疆哈族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統計學意義(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表7)。

2.5.3 新疆漢族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統計學意義(χ2 =1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表8)。

2.6 rs11136000及rs9331888位點單體型分析檢測及與AD 危險度的關聯分析 運用HaPloview4.2軟件進行單體型分析，顯示rs11136000及rs9331888位點進行連鎖不平衡及單體型分析，結果顯示rs11136000及rs9331888位點存在連鎖平衡(D’=0.764)，研究對象中單體型分析顯示有C-C、C-G、T-G3種單體型，果顯示3種單體型頻率在人群中分布差異無統計學意義。LD圖(見圖7)。單倍型分布(見表9)。

表1 AD組與對照組一般臨床資料比較

表2 CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表3 哈族CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表4 漢族CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表5 漢族與哈族AD CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表6 整體CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表7 哈族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表8 漢族 CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(%)

表9 CLU基因在正常組與AD組之間單倍型分布頻率

圖1 rs11136000位點電泳結果

圖2 rs11136000位點測序結果

圖3 rs931888位點電泳結果

圖4 rs931888位點測序結果

圖5 rs11136000KASP分型圖片

圖6 rs9331888KASP分型圖片

圖7 GLU基因rs11136000及rs9331888位點SNPs連鎖關系LD圖

3 討 論

CLU基因在笫八號染色體上，也被稱作載脂蛋白J(APoJ)基因，編碼凝聚素，位于染色體8P21-P12上，與APOE有一定相關性，是分布在外周循環系統和大腦中的一種多功能脂蛋白，參與脂質運輸，同時也參與Aβ的清除、細胞凋亡、膜循環、炎癥反應[6]。研究表明，CLU多態性可以通過改變Aβ積聚來調節AD易感性，且CLU變體可能通過其對Aβ沉積發揮作用和影響海馬萎縮[7]。研究表明載脂蛋白J血漿濃度與AD患者嚴重程度和疾病進展速度以及內嗅皮質和海馬萎縮有關[8，9]。AD的前驅期，MCI患者血漿載脂蛋白J水平升高也與較低的腦萎縮發生率有關，這種萎縮涉及海馬和內嗅皮質，即在早期階段影響大腦區域AD發病機制，結果表明聚集蛋白水平在AD前驅階段已開始以選擇性的方式沿AD發生級聯反應。這種保護性血漿反應可能至少部分地調節MCI向AD癡呆的進展[7]。2009年兩個大型GWAS首次報道CLU與LOAD顯著有關[4，5]，由此推測CLU基因與AD發病密切相關，可能掌握重要的線索來闡明與AD發病有關的機制。

我們首次分析了新疆哈薩克族人群CLU基因rs11136000 位點與AD的相關性。結果顯示CLU基因rs11136000 位點與AD風險相關，TT基因型和T等位基因(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)可能降低新疆哈薩克族人群AD的發病風險。有研究表明rs11136000等位基因T可延緩在MCI到AD進程[7]，有趣的是其他研究表明，與非攜帶rs11136000的G等位基因相比，在攜帶rs11136000的G等位基因的認知正常的個體中更容易發展成MCI或AD，且在記憶固有區域大腦局部腦血流量明顯增加[10]。在一項針對哥倫比亞人群研究[11]發現CLU基因rs11136000位點最小等位基因T能降低AD風險(OR= 0.66，P= 0.028)，其結果受年齡、血統、APoEε4狀態的影響。我們研究結果同SeshadriS等[12]在歐洲人群研究一致。然而一項關于巴西人群[13](70%高加索人及30%非高加索人)及印度人群[14]的研究未發現CLU基因rs11136000位點多態性與AD相關。Wang等[15]研究顯示中國漢族CLU rs11136000多態性與AD風險相關。同樣，Lu的研究結果表明CLU rs11136000多態性可能不是AD易感性影響南方漢族人群的因素[16]。總之CLU基因rslll36000在不同人群及種族研究結果并不一致。

本研究未發現新疆漢族及哈薩克族CLU rs9331888位點(χ2=0.680，P=0.7954，χ2=1.111，P=0.574)與AD有關聯性，我們的研究結果與Logue等[17]在非裔美國人中研究結果一致。有研究表明AD風險rs9331888基因與CLU血漿水平下降相關，它還修飾了CSF中微管相關蛋白的tau水平和Aβ(1～42)下降，其結果表明CLU內rs9331888多態性的次要等位基因(G)顯著與LOAD風險增加有關，且在為期兩年的隨訪研究中發現AD組中rs9331888處的SNPs與左側海馬體積顯著相關(P=0.004)[18]。一項關于土耳其人的研究顯示rs9331888與AD之間存在重要關系，GG基因型rs9331888可能增加發展AD的傾向，同時rs9331888的G等位基因與低凝聚素mRNA和血漿凝聚素水平相關；還觀察到更高的血漿凝聚素水平及凝聚素 mRNA水平與較低的MMSE相關，這表明較高的凝血素水平與疾病嚴重程度相關[19]。有趣的是，一項在中國藏族人群研究發現rs9331888G基因可能降低AD的發病率[20]。不同種族的rs9331888位點驗證研究目前結論尚不一致。本研究未發現其關聯性可能的其他原因：(1)研究樣本量相對較少，尚不能充分體現新疆哈薩克族人群整體基因分布情況；(2)在人群篩選方面，目前AD診斷仍以癥狀為主，診斷標準以各類心理學檢測評分作參考，難免存在評分上的主觀性造成誤差；(3)新疆漢族及哈薩克族人群SAD可能與CLU 基因rs9331888位點多態性確實無關聯。

總的來說，這是在新疆漢族及哈薩克族人中進行的為數不多相關性研究，研究發現CLU基因rs11136000位點多態性與SAD相關，攜帶T等位基因或者TT基因對降低哈薩克族人SAD發病率有一定作用，但漢族SAD與哈族SAD等基因型及等位基因比較差異均無統計學意義；CLU 基因9331888可能并非哈薩克族SAD的易感基因。