Aβ寡聚體損傷PC12細胞毒性研究

梁曉婷， 張丹丹， 梁文昭， 邵延坤， 閆亞韻

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種慢性進展性中樞神經系統退行性疾病。隨著人口老齡化的日益嚴重，患病率也隨之增加，成為威脅人類健康的重大殺手，是嚴重的社會和醫療問題[1，2]。目前認為β淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)異常沉積可能是誘發AD形成的關鍵因素。其中，Aβ42較Aβ40疏水性強，有更強的毒性及自我聚集活性，易形成不可溶的Aβ纖維體導致老年斑形成。早老素1(Presenilin1，PS1)為淀粉樣前體蛋白APP分解為Aβ的關鍵酶γ分泌酶的主要成分。自噬在AD等神經退行性疾病的發生、進展過程中起著核心作用。目前認為纖維狀Aβ毒性不如可溶性Aβ寡聚體，可溶性Aβ寡聚體是產生神經毒性作用的重要來源。但體內獲得可溶性Aβ很難，使其在體內聚集環境很難實現。所以，本研究通過Aβ寡聚體構建體外AD模型，探討Aβ寡聚體對于細胞活力、凋亡、Aβ42及PS1表達、自噬等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 未分化的半懸浮PC12細胞購自北京中國科學院細胞庫；Aβ42單體、Aβ40單體購自Anaspec；CCK-8試劑盒購自東仁化學科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Bioteke；caspase-3、Beclin 1、PS1 antibody購自Anaspec；羊抗鼠IgG-HRP購自MILLIPORE。電泳儀、轉移槽為BIORAD；酶標儀(BIOTEK)。

1.2 方 法

1.2.1 Aβ寡聚體的制備及CD譜分析 將Aβ40及Aβ42單體各取5 mg分別放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，該步在冰上進行，蓋上離心管蓋60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分裝每管100 μl，室溫使在冰上預冷的HFIP揮發，將干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用時肽膜放在冰上，每管在超凈臺中加DMSO充分溶解，使終濃度為5 mmol/L，吹打混勻，加無酚紅的DMEM培養基，盡量不要超過100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，離心取上清液，放入-80 ℃冰箱。取制備的Aβ寡聚體，委托中科院大分子國家重點實驗室進行CD譜分析。

1.2.2 Aβ42與Aβ40混合物寡聚體的制備 將Aβ40及Aβ42單體各取5 mg分別放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，該步在冰上進行，蓋上離心管蓋60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分裝每管100 μl，按摩爾量比例為1∶9，3∶7，4∶6，1∶0，4∶0，10∶0將Aβ42與Aβ40混合到新的EP管中，保證終濃度為1 mmol/L。室溫使在冰上預冷的HFIP揮發，將干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用時肽膜放在冰上，每管在超凈臺中加DMSO充分溶解，使終濃度為5 mmol/L，吹打混勻，加無酚紅的DMEM培養基，盡量不要超過100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，離心取上清液，放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 細胞培養及Aβ損傷PC12細胞AD模型制備 將未分化的半懸浮PC12細胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱內孵育，按1∶4～1∶3進行細胞傳代，第10～30代的分化細胞，以2×104密度接種到6孔板中，用于AD模型的制備，將1.2.2中制備的濃度為100 μmol/LAβ混合物寡聚體加到培養基中，37 ℃孵育24 h后進行實驗。

1.2.4 CCK-8檢測 生長良好的PC12細胞每孔8000～10000個接種于96孔板上，長滿后加不含血清的DMEM高糖培養基培養，24 h后加入10 μmol/L 的Aβ混合物寡聚體，作用24 h后棄上清液，每孔加入200 μl培養基及20 μl CCK-8試劑避光孵育，酶標儀測定1 h后450 nm處OD值，重復3次。

1.2.5 ELISA法檢測Aβ損傷PC12細胞Aβ42的表達 Aβ寡聚體損傷后的PC12細胞經細胞裂解液RIPA裂解、離心后取上清移入新的EP管，制備總蛋白。用酶聯免疫吸附實驗雙抗夾心法檢測Aβ42的表達，具體方法按說明書。

1.2.6 Western blot 檢測Aβ損傷PC12細胞caspase-3、PS1、Beclin 1的表達 同1.2.5制備總蛋白，BCA法測蛋白濃度、 SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，一抗稀釋比例1∶1000，孵育 4 ℃ 過夜，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)稀釋比例1∶2000，37 ℃孵育1 h。在暗室曝光顯影。用Image J 圖像處理軟件分析目標條帶的光密度，求目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值。

1.2.7 免疫組化檢測Aβ損傷PC12細胞PS1表達 血清封閉，一抗(PS1 antibody)稀釋比例1∶200，4 ℃過夜孵育，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)孵育，37 ℃，DAB染色，封片劑封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法 SPSS17.0統計，各組數據間進行t檢驗分析，當P<0.05時，認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Aβ42 CD譜分析 用圓二色譜儀對各點聚合的Aβ42分析，用在線軟件計算α-螺旋、β折疊、無規卷曲的含量，發現3 h和12 h二級結構幾乎無改變，24 h二級結構β折疊升高，48h其β折疊降低。提示Aβ42寡聚體聚合24h進行實驗的意義較大。

2.2 CCK-8檢測Aβ損傷PC12細胞活力 Aβ寡聚體混合物總量相同時，Aβ42/Aβ40不同比例損傷PC12細胞時，比值微小變化(3 μmol/L∶7 μmol/L到4 μmol/L∶6 μmol/L)時，PC12細胞活力增加(a：P<0.05)，但Aβ42的含量為10 μmol/L，PC12細胞的活力表現為下降(b：P<0.05)，說明在一定濃度范圍內Aβ寡聚體可以使PC12細胞活力增強，并且與Aβ42的含量相關，超過一定范圍后活力下降。Aβ42蛋白的含量相同時，Aβ42蛋白的濃度增加(1 μmol/L～4 μmol/L)時，PC12細胞的活力增加(c：P<0.05)，且具有劑量依賴性(見圖1)。

2.3 Aβ損傷PC12細胞Caspase 3表達 Aβ寡聚體總量相同時，4∶6組，與1∶9組、3∶7組相比，caspase-3的表達增多，且差異有統計學意義(a：P<0.05)，Aβ寡聚體中Aβ42含量相同時，Caspase 3表達增加，差異有統計學意義(b：P<0.05，c：P<0.05)，Aβ42/Aβ40比值為4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)組比1∶0(1 μmol/L∶0 μmol/L)組caspase-3表達增加，有統計學差異(d：P<0.05)。說明Aβ寡聚體損傷PC12細胞引起細胞凋亡，Aβ42比例越大，凋亡越明顯，且具有劑量依賴性，Aβ40可以減輕Aβ42引起的細胞凋亡，對細胞起保護作用。綜上，通過不同比例Aβ42/Aβ40混合物寡聚體損傷PC12細胞，能夠在體外模擬AD的病理過程，成功建立了PC12細胞AD模型(見圖2)。

(A)a示與1∶0組相比，P<0.05，b示與4∶0組相比，P<0.05。(B)Pure示只有Aβ42，Mix示Aβ42與Aβ40混合物，a示與Mix組相比，P<0.05，b示與Mix組相比，P<0.05，c示與1∶0組相比，P<0.05。(C)a示與1∶0組相比，P<0.05，b示與4∶0組相比，P<0.01

(A)β-actin為內參；(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與1∶9組相比，P<0.05，c示與4∶6組相比，P<0.05，d示與1∶0組相比，P<0.05

2.4 Aβ損傷PC12細胞Aβ42的表達 ELISA法檢測示在一定濃度范圍內，Aβ寡聚體混合物總量相同時，Aβ42/Aβ40不同比例損傷PC12細胞時，當比值微小變化時，Aβ42的表達量顯著且比值越大，Aβ42表達量越高，具有統計學意義(b：P<0.05)。說明Aβ寡聚體混合物損傷PC12細胞Aβ42的聚集與Aβ寡聚體混合物中Aβ42的比例顯著相關。單純的Aβ42寡聚體與Aβ42與Aβ40混合物對比，當兩者Aβ42含量相同，單純的Aβ42寡聚體引起Aβ42表達增加，且具有劑量依賴性(c：P<0.01)，說明Aβ40可以減少Aβ42的表達，對細胞有保護作用(見圖3)。

(A)a示與1∶9組相比P<0.05，b示與3∶7組相比P<0.05，c示與4∶6組相比P<0.01。(B)a示與1∶9組相比P<0.05，b示與4∶6組相比P<0.05，c示與1∶0組相比，P<0.01

2.5 Aβ損傷PC12細胞PS1的表達 Western blot檢測結果示：Aβ寡聚體總量相同時，PS1的表達差異不明顯，Aβ42/Aβ40比例為10∶0時與4∶6(4 μmol/L：6 μmol/L)組，PS1的表達并不增加，但4∶6組與1∶9組、3∶7組相比，PS1的表達增多，且差異有統計學意義(a：P<0.05，b：P<0.05)，表明AD的發病過中，Aβ40含量在一定程度的減少可激活PS1的表達。單純的Aβ42寡聚體與Aβ42與Aβ40混合物對比，當兩者Aβ42含量相同，PS1的表達差異沒有統計學意義(b：P>0.05)(見圖4)。

2.6 Aβ損傷PC12細胞Beclin 1的表達 Aβ混合物寡聚體中Aβ42/Aβ40比例變化時，Aβ42/Aβ40值4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)組、4：0組比1∶9組Beclin 1的表達增加；Aβ42含量相同時，Aβ42/Aβ40從1∶9(1 μmol/L∶9 μmol/L)到1∶0、從4∶6到4∶0，Beclin 1的表達顯著增加，差異有統計學意義(a：P<0.05，b：P<0.01)，說明Aβ42可以激活自噬，且自噬的強弱與Aβ42在寡聚體中的含量相關，具有劑量依賴性(e：P<0.05)。當Aβ42/Aβ40的比值為10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)，Beclin 1的表達明顯降低，自噬受到抑制，說明Aβ42對細胞自噬的激活在一定的濃度范圍內有效，當濃度過大時，細胞自噬減弱，引起細胞損傷(見圖5)。

(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與3∶7組相比，P<0.05。(C)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與1∶0組相比，P>0.05，差異無統計學意義

(A)β-actin為內參；(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與4∶6組相比，P<0.01，c示與1∶0組相比，P<0.05，d示4∶0組相比，P<0.01，e示于1∶0組相比，P<0.05

3 討 論

Aβ蛋白是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)裂解產生的，不同個體內有不同的Aβ蛋白的譜系，表現為Aβ1～43、Aβ1～42和Aβ1-40不同比例的混合。正常人體內大約90%為Aβ40，只有少數為Aβ1～43、Aβ1～42。盡管這些β淀粉樣蛋白只有幾個氨基酸的差異，但功能卻相差很遠。Schellenberg等[3]于1992 年首次發現PS-1 基因與家族性AD發病有關，PS1屬于進化過程中非常保守的蛋白質，主要表達于大腦新皮質、海馬。PS1在生物體中有重要作用，在APP及Notch1蛋白的水解過程中扮演著重要角色。目前認為，PS1參與形成γ分泌酶復合物來調節Aβ的生成。γ分泌酶復合物由PS、Nicastrin、APH1和PEN2構成，PS1是γ分泌酶復合物的活性中心。自噬能清除受損細胞器及異常折疊的蛋白質，目前研究認為自噬是可以減輕神經毒性及清除神經元內異常沉積的Aβ的潛在治療靶點。自噬囊泡在AD小鼠腦中大量積聚可使軸突受損[4]。Beclin 1是細胞自噬的關鍵調控因子，與配體結合，調節細胞內自噬的活性[5]。

為成功建立Aβ損傷的PC12細胞AD細胞模型，Aβ標本中β片層結構的含量為制備的關鍵因素。因為生理狀態下Aβ是可溶性的α螺旋結構，病理狀態下Aβ為容易形成纖維狀或沉積的β片層結構。在病理狀態下Aβ自發快速形成β片層結構，進而形成纖維、沉積發揮毒性。Aβ寡聚體比纖維狀的Aβ毒性更強，且其毒性依賴于形成β片層結構的能力[6，7]。本研究應用體外制備的Aβ寡聚體損傷PC12細胞，同時檢測Aβ寡聚體聚合不同時間點β片層結構的含量，研究結果顯示Aβ寡聚體聚合24 h含量最高，故選用聚合24 h的Aβ寡聚體制備AD模型。用CCK-8檢測細胞活力、Western blot測凋亡相關蛋白caspase-3表達鑒定PC12細胞AD模型，通過不同Aβ42寡聚體與Aβ40寡聚體的混合物比例損傷PC12細胞，說明在一定的濃度范圍內(本研究為10 μmol/L)，細胞凋亡率小，細胞的活力增加，研究此階段的病理及機制可為AD的治療及預防提供新的靶點。

目前的研究[8，9]結果顯示，PS1基因突變可因為改變了γ-分泌酶對APP的剪切位點，使纖維原性較強、易聚集、神經毒性大的Aβ42生成增多從而引發AD。但Aβ損傷細胞后是否影響PS1功能目前少有研究。本研究通過Aβ寡聚體的混合物損傷PC12細胞，觀察Aβ對PS1產生的影響，結果發現：Aβ42/Aβ40比例為4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)時與1∶9、3∶7比，Aβ42的表達增加，PS1表達的增加遠小于Aβ42的增加，當Aβ42/Aβ40比值由4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)到10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)時，Aβ42表達顯著增加，而PS1的表達基本無變化。說明在AD的發病中，Aβ40含量在一定程度的減少可激活PS1的表達，Aβ42含量的增加可明顯增加Aβ42的表達，并且具有劑量依賴性，但Aβ42含量增加時PS1表達沒有顯著變化。研究結果提示，Aβ42/Aβ40比值增加時，可能會引起PS1結構與功能的改變。單粒子電子顯微鏡及FLIM證實γ分泌酶的成熟體有不同的構象位點[10～12]，在PS1突變的轉基因小鼠中發現，PS1與γ分泌酶上緊密結合的區域，可協助長鏈的Aβ肽段的產生[13]，因此把這個位點稱為“closed”，化合物可通過調節PS1向“open”位點發生構象變化就能產生低分子量的Aβ肽段[11，14]。Aβ42含量的增高能夠激發PS1向病理位點的構象變化，這一過程通過細胞內的鈣超載實現[15]，Aβ42含量的增高引起PS1的改變機制可能與細胞內Aβ42引起的鈣超載導致細胞損傷相關[16]。氧化應激及胞內Ca2+的增加可使PC12細胞功能異常的PS1表達增加[17]。另有證據證明：PS可調節細胞內Ca2+的穩態，且不依賴γ-分泌酶的活性[18]。最近的研究做出推斷鈣超載可能為AD病理生理過程惡化的罪魁禍首[19～21]。

綜上，本研究成功模擬了體外AD的病理過程，構建AD早期的細胞模型。并檢測了Aβ損傷PC12細胞Beclin 1的表達，結果說明AD的早期階段一定的濃度范圍內Aβ42激活細胞自噬，當濃度過大時，細胞自噬減弱，引起細胞損傷，因此可將此階段的病理過程作為治療及預防的靶點。Aβ寡聚體不改變細胞內PS1的含量，可能是通過改變PS1的結構和功能引起Aβ沉積，但Aβ的毒性及機制仍不十分清楚，有待進一步探討。