高糖誘導大鼠海馬神經元細胞模型建立及細胞凋亡的影響

許永劼， 李程程， 朱金鳳， 朱麗英， 高 超， 代龍光， 錢 雯， 張競之， 潘 衛，3，李 興

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病嚴重的慢性并發癥之一，是由糖尿病代謝紊亂導致的中樞神經系統損壞，從而引起大腦神經生理及結構改變和認知功能障礙的疾病[1]。目前，有關于糖尿病腦病動物及細胞模型的報道少見，因此建立一種穩定的糖尿病腦病的細胞模型具有重要意義。

現階段有研究認為糖尿病腦病與海馬神經元凋亡密切相關，高血糖能誘導內皮細胞功能障礙，從而加速細胞凋亡而導致血管內皮受損[2]。細胞凋亡受到多種凋亡相關基因的調控，其中Bcl-2和Bax是細胞凋亡調控的重要因素，Bcl-2主要功能是抑制細胞凋亡作用，保護細胞；而Bax則起到促進細胞凋亡的作用，加速細胞凋亡[3]。本研究旨在建立一種高糖誘導的糖尿病腦病細胞模型，探討高糖對海馬神經元細胞凋亡的影響，為進一步從細胞水平研究糖尿病腦病提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和實驗動物 取出生24 h以內的SD新生鼠，體重約5～7 g(合格證號：SCXK(黔)2018-0001，由貴州醫科大學實驗動物中心供給) 試劑：神經元專用Neurobasal-A培養基、DMEM培養基、B-27神經元營養因子、0.25%胰蛋白酶0.25%胰蛋白酶(無EDTA)(美國Gibco公司、胎牛血清(上海臻諾生物科技有限公司)馬血清(美國Hyclone公司)、L-谷氨酰胺、CCK-8試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)細胞凋亡凋亡檢測試劑盒(凱基生物科技發展有限公司)、兔源β-actin單克隆抗體、兔源 Bcl-2單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體(購自美國affinity公司)。

1.2 主要儀器 Thermo-3111型CO2培養箱、IMARK型酶標儀(美國Bio-Rad公司)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、Western blot垂直電泳儀、Western blot電泳轉印系統(美國Bio-Rad公司)、流式細胞儀(美國 Beckman 公司)。

1.3 原代培養海馬神經元細胞 取出生24 h內SD乳鼠的海馬組織，將海馬組織放在中低溫PBS，顯微鏡下利用眼科鑷快速分離海馬組織血管包膜，剪碎組織、移液器吹打混勻20次、離心850 r/min離心5 min、棄上清液后，加入0.125%胰蛋白酶消化，37 ℃培養箱消化15 min，每隔5 min輕輕搖晃，加入等體積的血清終止消化，200目篩網過濾，制成神經元單細胞懸液，種植于預先用L-多聚賴氨酸包被24h的6孔板和96孔板中(使用前PBS沖洗3次)，10 h后將種植培養基(83%DMEM培養基+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗+10%馬血清+5%胎牛血清)棄去，PBS清洗3次，換成維持培養基(96%Neurobasal-A+2%B-27+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗)培養，以后每3.5 d量換液一次。

1.4 NSE免疫組化純度鑒定 將細胞懸液以1～5×105個/ml的濃度接種到提前放置了細胞爬片(爬片經過多聚賴氨酸處理)的6孔培養板中，海馬神經元培養至5 d，將培養板中細胞爬片取出，并用PBS沖洗3次，然后加入4%多聚甲醛固定30 min，再次使用PBS漂洗3次。全部操作按照NSE免疫組化染色試劑盒操作說明書進行海。顯微鏡下觀察，隨機選取觀察視野，計數視野下100個細胞中海馬神經元的數量，重復5次后，取觀察的平均值，計數陽性細胞百分數，為海馬神經元細胞純度。

1.5 高糖濃度摸索 細胞培養至5 d，將海馬神經元細胞隨機分為7組，分別是將細胞分為25 mmol/L組(對照組)；45 mmol/L-24 h組、45 mmol/L-48 h組、45 mmol/L-72 h組和60 mmol/L-24 h組、60 mmol/L-48 h組、60 mmol/L-72 h組。每組達到作用時間后，CCK-8法檢測各組海馬神經元細胞活性，全部操作嚴格按照CCK-8試劑盒說明書進行。為減低試驗誤差，每組平行做6孔，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃溫箱孵育1.5 h后，使用酶標儀在規定波長450 nm測定OD值。

1.6 高糖作用時間摸索 細胞培養5 d，將細胞分為25 mmol/L組(對照組)、45 mmol/L-24 h實驗組、45 mmol/L-48 h實驗組組、45 mmol/L-72 h實驗組，達到作用時間后，提取細胞蛋白，吸取上清BCA法定量蛋白濃度。以含20 μg蛋白質溶液為上樣量，經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過濕轉法，將目的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛乳室溫下封閉2 h，加入兔抗β-actin(1∶5000) 、兔抗Bcl-2(1∶1000)、兔抗Bax(1∶1000)于4℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10 min；分別加入HRP標記的羊抗兔Ig G(1∶20000) 二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10 min；采用ECL法發光顯示，現配顯色工作液，采用凝膠成像系統進行圖像收集，使用ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析比較，計算先對表達量。每組實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測 細胞培養至5 d分為25 mmol/L組和最適高糖組(45 mmol/L-48h)組，達到作用時間后，棄培養基，PBS清洗3遍，每次1 min，加入適量0.125%胰蛋白酶(不含EDTA)后，放置在37 ℃的CO2培養箱中消化細胞20 min，每隔5 min輕輕搖晃一下，加速細胞脫落。顯微鏡下觀察消化效果，細胞脫落70%左右，加入適量胎牛血清終止消化。采用用低速離心機1000 r/min離心5 min，收集消化后脫落細胞，細胞計數后，以5×104的濃度為一個標本上樣量，按照操作說明書，加入500 μl結合液重懸神經元細胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶，輕輕混勻，所有操作均避光進行，室溫下避光孵育10 min，1 h內流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。

1.8 統計學方法 數據收集整理后用，采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析處理，當P<0.05說明檢測結果的顯著性差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 原代海馬神經元培養 海馬神經元細胞形態變化：細胞種植于培養板1 d后，細胞呈小圓形，透亮且散在分布均勻，邊緣有光暈(見圖1)；種植3 d后，細胞基本貼壁成功，部分神經元細胞長出突觸(見圖2)；生長至5 d，細胞胞體進一步長大，成圓形或者椎體形，突觸生長迅速，形成稀疏的網狀結構(見圖3)；生長至7 d，細胞胞體飽滿，細胞表明光暈明顯，形成密集的網狀結構，細胞有聚集生長現象(見圖4)。

2.2 原代海馬神經元純度鑒定 NSE免疫組織化學染色后，光學顯微鏡下觀察爬片中細胞形態完整，細胞分布均勻，可見清晰的網狀結構，其中細胞胞體和大部分突觸為黃棕色顆粒，為陽性細胞即海馬神經元(見圖5)，經觀察計數后計算陽性細胞百分數，本實驗神經元純度可達85%以上，生長狀態良好，生長密度適宜，可進行后續試驗。

圖1 神經元生長1 d后(×200)

圖2 神經元生長3 d后(×200)

圖3 神經元生長5 d后(×200)

圖4 神經元生長7 d后(×200)

圖5 NSE染色后的海馬神經元(×200)

2.3 高糖濃度的確定 CCK-8檢測細胞活性結果(見表1)，45 mmol/L組作用24 h、48 h、72 h后，細胞平均存活率均在80%以上，而60 mmol/L組作用24 h、48 h、72 h后，細胞活性全部低于80%。根據美國藥典細胞毒性分級[4]，細胞存活率≥80%屬于1級細胞，可用于后續實驗，即本研究高糖濃度確定為45 mmol/L。

2.4 高糖作用時間的確定 Bcl-2和Bax是經典凋亡相關蛋白，與細胞凋亡情況密切相關。Western blot結果顯示，隨著糖濃度的升高，與對照組相比，45 mmol/L-24組、45 mmol/L-48 h組、45 mmol/L-72 h組中海馬神經元內均Bcl-2表達下降、Bax表達上升，差異有統計學意義(P<0.01)(見圖6)；與45 mmol/L-24 h組比較，Bcl-2在45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組下降明顯(P<0.05)，但45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無統計學意義(P>0.05)與45 mmol/L-24 h組比較，Bax在45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組升高明顯(P<0.01)，但45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無統計學意義(P>0.05)。結果顯示，高糖作用時間為48h為最適時間，為后續試驗奠定基礎。

與對照組比較**P<0.01；##P<0.01

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 采用流式細胞儀檢測各組海馬神經細胞的凋亡情況。Flow Cytometry結果顯示，對照組海馬神經細胞凋亡率為2.1%±0.3%，高糖作用48h后細胞凋亡率為12.5%±0.5%。與對照組對比，高糖組海馬神經元細胞凋亡率顯著上升(P<0.01)(見圖7)。

與對照組比較**P<0.01

表1 45 mmol/L和60 mmol/L組細胞平均存活率(%)及細胞毒性分級(n=5)

3 討 論

糖尿病腦病患者臨床表現為輕、中度的認知功能障礙，學習和記憶能力下降，語言理解等能力降低，且與各種神經退行性疾病均有密切聯系。現研究認為高血糖引起機體代謝紊亂，繼發導致大腦海馬區結構功能異常，如突觸可塑性改變和神經遞質釋放受到影響，最終導致機體認知功能障礙[5]。目前，國內外對糖尿病腦病模型構建仍處在探索階段，無論是動物水平還是細胞水平均缺少有效的途徑，而越來越多的糖尿病患者后期出現認知功能障礙，最終發展為糖尿病腦病[6]。因此，建立一種穩定的糖尿病腦病的模型具有重要意義。

海馬體(Hippocampus)，又名海馬回，是大腦學習記憶的關鍵部位。臨床研究數據發現，2型糖尿病與認知功能障礙密切相關，2型糖尿病患者海馬體積減少，而海馬區是最先受糖尿病影響的腦區[7]。因此，本研究選擇海馬神經元為研究對象，探討高糖作用時間和濃度對海馬神經元的影響。本研究成功培養原代海馬神經元，經NSE免疫組織化學染色鑒定純度達85%以上，達到后續試驗要求。研究發現神經元細胞具有較高代謝率，在大量體外培養實驗中，發現25 mmol/L基礎糖濃度是維持神經元生長發育及突觸生長最適濃度[8]。本研究根據海馬神經元高糖模型的研究[9，10]及張貝貝等認為高糖環境會引發血管內皮細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax水平變化[11]，探討在不同糖濃度和作用時間下培養海馬神經元細胞，以觀察隨著糖濃度的增加是否對神經元細胞內凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達有影響，從而獲得最適的糖作用時間。還有研究[12]發現，海馬神經元在糖濃度達50 mmol/L培養基培養時，細胞中突觸相關蛋白SNAP-25、synaptotagmin-1和VGluT-1外表達顯著降低，從而導致某些蛋白質在突觸中運輸情況受到影響，最終影響神經元細胞活性。本研究運用45 mmol/L糖濃度培養海馬神經元，海馬神經元生長狀態受到一定程度影響，細胞形態較完整，胞體較飽滿，光暈比較明顯。CCK-8檢測結果顯示神經元細胞存活率均在80%以上。而經過45 mmol/L糖濃度作用48 h可引起神經元內Bcl-2和Bax表達水平較25 mmol/L組顯著變化，但隨著作用時間的延長，45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無統計學意義，因此最終確定45 mmol/L糖濃度培養48h為最適糖濃度和作用時間。

現階段基于神經元細胞凋亡學說研究糖尿病腦病的發病機制成為當前主流。細胞凋亡是細胞的程序性死亡，受到多種因素的調控，如環境、基因、凋亡相關蛋白等。在正常大鼠海馬區內，Bc1-2扮演著抑制細胞凋亡的角色，保護細胞存活，當Bc1-2與Bax維持數量上的平衡，機體的凋亡水平處于正常階段；當機體受到某些因素的刺激后，Bax發揮作用，介導細胞凋亡的產生，由此可見Bc1-2與Bax水平的動態平衡是維持機體凋亡的重要因素[13]。Lei等[14]研究發現大黃素可減輕高糖誘導PC-12細胞凋亡情況，通過增加Bax/Bcl-2比率，減低caspase-3和caspase-9的表達達到保護PC-12細胞的作用，降低細胞凋亡水平。閆斌等[15]發現槲皮素能夠減輕高糖誘導下海馬神經元的凋亡情況，其作用機制是增加p-Akt蛋白的表達，進而增加Bcl-2蛋白的表達，抑制Bax蛋白的表達。本研究與閆斌等的實驗結果一致，隨著糖濃度的增加，海馬神經元內凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達水平發生變化，其中Bcl-2表達下降而Bax表達上升。在確定最適高糖濃度和作用時間后，我們運用流式細胞術檢測高糖組的凋亡情況，發現與對照組相比，海馬神經元的細胞凋亡率顯著上升。結合凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的變化情況，我們推測，高糖引起海馬神經元細胞凋亡增加可能是通過改變凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達實現的，但具體的作用機制仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建一種高糖誘導糖尿病腦病細胞模型，為后續的研究提供幫助；并且發現高糖會導致海馬神經元細胞凋亡率升高，其原因可能與凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達改變有關。