miR-139在Aβ25-35誘導Neuro-2a細胞損傷中的機制研究

孫林琳， 楊松林， 王 曄， 段淑榮

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關的神經退行性疾病[1]。典型的AD臨床表現包括記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為改變等[2]。流行病學調查顯示，65歲以上老年人AD患病率在我國約為3%～7%，女性高于男性[3]。隨著年齡的增長，AD患病率逐漸上升，目前我國人口平均預期壽命逐漸增加，AD已經成為重要的健康問題及社會問題。

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的生成與清除失衡是導致AD發生的起始事件[4]。microRNAs(miRNAs)是一類內源性非編碼的RNA分子，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(3’BUTR)結合而導致翻譯抑制或mRNA降解進而調節疾病的發生、發展[5，6]。以往的研究中觀察到AD患者和動物模型中存在多種miRNAs異常表達[7，8]。同時，越來越多的證據表明，miRNAs通過調節抗體的產生和炎癥反應參與AD的發生及發展[9]。miR139是一種腦功能調節的重要因子，參與多種神經、精神疾病的病理過程[10，11]，Noh等報道miR-139在AD小鼠大腦組織中表達上調[12]。然而，miR139在AD發病機制中的具體作用和潛在分子機制還不十分清楚。

1 材料和方法

1.1 主要材料 小鼠來源神經瘤母細胞系Neuro-2a購自于美國American type culture collection公司。Aβ25-35購自于美國Sigma公司。miR-139-mimics(No. miR20004552-1-5)，miR-NC-mimics，miR-139 inhibitor(No. miR10000250-1-5)以及miR-NC-inhibitor試劑盒均購自于廣州Ribobio公司。逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。FOXO1和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 小鼠來源神經瘤母細胞系Neuro-2a在含10%胎牛血清的1640培養基中于37 ℃，5%二氧化碳濃度條件下培養。Aβ25-35溶于DMSO，保持在37℃ 備用[13]。利用不同培養濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20 μmol/L)Aβ25-35 誘導Neuro-2a細胞24 h，隨后留取細胞進行相關實驗。

1.2.2 細胞轉染 通過Lipofectaminetm 2000(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA，美國)分別將50 nM miR-139-mimics，miR-NC-mimics，miR-139 inhibitor以及miR-NC-inhibitor轉染到Neuro-2a細胞中，48h后提取RNA。

1.2.3 RNA提取與實時PCR 從Neuro-2a細胞中提取總RNA。通過逆轉錄試劑盒進行轉錄。通過ABI7900實時PCR系統(應用生物系統公司，福斯特城，CA，美國)進行檢測。比較2-ΔΔCt法進行相對定量，引物序列如下：FOXO1-F：5’-GCTTAGAGCAGAGATGTTCTCACATT-3’；FOXO1-R：5’-CCAGAGTCTTTGTATCAG GCAAATAA-3-3’；GAPDH-F：5’-AGCCTCCCGCTTCGCTCTCT-3’；GAPDH-R：5’-GCGCCCAATACGACCAAATCCGT-3’；miR-139-F：5’-UGGAGACGCGGCCCUGUUGGAG-3’；miR-139-R：5’-CAAACCAAAGATAAACGTGGATT-3’；U6-F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6-R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH為檢測FOXO1表達的內參，U6為檢測miR-139表達的內參。

1.2.4 Western blot分析 所有的蛋白來自Neuro-2a細胞，采用RIPA和PI(蛋白抑制劑，1∶100)提取蛋白。由10%的SDS-PAGE分離并轉移到醋酸纖維素膜上。膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵育其特異性抗體FOXO1抗體和β-actin抗體。拍照并用圖像分析軟件(Odyssey)進行光密度積分值分析。

1.2.5 熒光素酶報告基因分析 miRNA靶標預測軟件(www. TargetScan. org)分析結果顯示，FOXO1與miR139有潛在的結合位點(見圖2A)。因此，我們用熒光素酶報告法檢測miR-139是否能直接與FOXO1的3’BUTR區結合。利用PCR將預期作用位點及其附近序列重組入pmirglo載體，命名為pmirglo-FOXO1-wt。同時，我們構建了刪除作用位點的FOXO1 3’-UTR序列，并重組入pmirglo載體，命名為pmirglo-FOXO1-mut。

為了分析miR-139與FOXO1的3’-UTR預測作用位點的直接作用，我們將5×103個Neuro-2a細胞接種于96孔板，24 h后，通過Lipofectamine 2000共轉染pmirglo-FOXO1-wt或pmirglo-FOXO1-mut。48 h后收集細胞，按照實驗流程，通過Luciferase報告檢測系統檢測熒光素酶活性(Promega，USA)。

1.2.6 caspase-3活性測定 利用不同培養濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20μmol/L)Aβ25-35處理24 h后，收集Neuro-2a細胞。按照說明書中操作流程通過caspase-3比色分析儀(KeyGEN，南京)在405 nm的吸光度下檢測caspase-3活性。

1.2.7 NF-κB活性測定 利用不同培養濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20μmol/L)Aβ25-35處理24 h后，收集Neuro-2a細胞。按照說明書中操作流程通過NF-κB比色分析儀(碧云天，北京)在570 nm的吸光度下檢測NF-κB活性。

2 結 果

2.1 Aβ25-35對Neuro-2a細胞miR-139和FOXO1表達的影響 應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L、5 mmol/L、10和20 mmol/L)培養Neuro-2a細胞24 h，通過qRT-PCR以及Western blot方法檢測Aβ25-35對Neuro-2a細胞中miR-139和FOXO1的表達。結果顯示，Neuro-2a中miR-139的表達呈Aβ25-35劑量依賴性顯著上升(P<0.05，見圖1A)，FOXO1的mRNA及蛋白表達呈Aβ25-35劑量依賴性顯著降低(P<0.05，見圖1B、圖1C)，表明miR-139和FOXO1參與Aβ25-35誘導的神經毒性，兩者表達呈負相關。

2.2 miR-139對Neuro-2a細胞FOXO1的調控作用 熒光素酶報告試驗結果表明(見圖2B)，相對于陰性對照組，過表達miR-139能夠顯著抑制FOXO1熒光素酶的活性；刪除預測的miR-139作用位點后，FOXO1的熒光素酶活性不能被抑制，印證之前預測的miR-139可直接作用于FOXO1的3’BUTR區。

進一步，通過qRT-PCR以及Western blot方法檢測轉染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對照物到Neuro-2a細胞后FOXO1的表達。結果顯示，過表達miR-139能夠明顯降低Neuro-2a細胞中FOXO1的mRNA及蛋白表達水平(P<0.05，見圖2C、圖2D)，而低表達miR-139的作用與其相反。以上結果從多水平證明FOXO1是miR-139在Neuro-2a細胞中的直接作用靶點。

2.3 miR-139對Aβ25-35介導的Neuro-2a細胞增殖及凋亡的影響 分別將miR-139抑制物及陰性對照物轉染到Neuro-2a細胞，各稱為靜默組及對照組。隨后將轉染的Neuro-2a細胞暴露于不同濃度Aβ25-35下24h，應用CCK-8法檢測細胞活力、caspase-3活性檢測細胞凋亡、ELISA方法檢測NF-κB濃度。

qRT-PCR實驗證實，與對照組相比，靜默組Neuro-2a細胞miR-139的表達顯著降低(P<0.05，見圖3A)，miR-139抑制物在Neuro-2a細胞中可發揮作用。接下來CCK-8法顯示，與對照組相比，靜默組Neuro-2a細胞存活率高，在Aβ25-35較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)時差異顯著(P<0.05，見圖3B、圖3C)。caspase-3活性檢測證實，與對照組相比，靜默組Neuro-2a細胞caspase-3活性降低，在Aβ25-35較高濃度(10和20 mmol/L)時差異顯著(P<0.05，見圖3D)。

NF-κB介導的細胞凋亡作用在AD發病機制中起重要作用[14]。我們通過觀察NF-κB的活性來研究miR-139對Aβ25-35誘導的Neuro-2a細胞凋亡的影響。ELISA檢測顯示，Aβ25-35處理Neuro-2a細胞后，與對照組相比，靜默組NF-κB濃度降低，在Aβ25-35較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)時差異顯著(p<0.05，見圖3E)。

以上結果表明，抑制miR-139表達減弱了Aβ25-35誘導的細胞毒性和NF-κB途徑的細胞凋亡，且具有Aβ25-35劑量依賴性。

A：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細胞，qRT-PCR檢測miR-139表達情況；B：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細胞，qRT-PCR檢測FOXO1 mRNA表達情況；C：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細胞，Western blot檢測FOXO1蛋白表達情況*P<0.05

A：預測的 miR-139與FOXO1 3’UTR區結合位點；B：Luciferase分析報告；C：qRT-PCR檢測轉染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對照到Neuro-2a細胞后FOXO1 mRNA的表達；D：Western blot方法檢測轉染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對照到Neuro-2a細胞后FOXO1蛋白的表達*P<0.05

A：qRT-PCR方法檢測轉染miR-139 inhibitor及陰性對照物后Neuro-2a細胞中miR-139的表達；B-C：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育轉染 miR-139 inhibitor及陰性對照物的Neuro-2a細胞24 h，CCK-8法檢測細胞增殖能力；D：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育轉染 miR-139 inhibitor及陰性對照物的Neuro-2a細胞24 h，caspase-3 法檢測細胞凋亡；E：應用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/Land 20 mmol/L) 孵育轉染 miR-139 inhibitor及陰性對照物的Neuro-2a細胞24 h，ELISA法檢測NF-κB水平*P<0.05

3 討 論

Aβ誘導的神經毒性包括炎癥和神經元凋亡，在AD的發病過程中起重要作用[13]。Aβ25-35被廣泛用于體外和體內AD模型的誘導[15]。本研究中，我們證明Aβ25-35可引起小鼠Neuro-2a細胞中miR-139表達升高、FOXO1表達降低。并證實FOXO1是miR-139的直接作用靶點。此外，我們發現miR-139通過激活NF-κB通路，參與Aβ25-35誘導的神經細胞毒性及凋亡作用。

miR-139是一種廣泛存在于人體并發揮重要作用的一種miRNA[16]。以往對miR-139的研究多集中于腫瘤領域[17]。近年來發現其在多種神經、精神系統疾病中發揮作用。Tang等研究發現，在快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬中，mir-139的表達明顯高于對照組，海馬內注射miR-139也可損害海馬依賴性學習和記憶的形成。相反，在小鼠海馬中下調miR-139可改善小鼠的學習和記憶功能[18]。在本研究中，我們證明Aβ25-35以劑量依賴的方式升高了Neuro-2a細胞中miR-139的表達。抑制miR-139功能減弱了Aβ25-35誘導的細胞毒性和細胞凋亡。與Tang等觀察到的miR-139促進AD發生結果相一致。

在腦腫瘤的研究中發現，miR-139可直接作用于胰島素樣生長因子、過氧化物酶體增殖物激活受體γ等多個靶點參與膠質瘤的發生發展，并影響腦功能網絡[19]。FOXO1基因敲除小鼠隨著年齡的增長，神經元分化、增殖、存活、自我更新受損[20]。本實驗發現在Neuro-2a細胞中，miR-139可直接靶向作用于FOXO1，調節后者的mRNA及蛋白表達。提示FOXO1可能是miR-139參與Aβ25-35細胞毒性作用的重要通路，miR-139通過抑制FOXO1進而影響神經元內相關基因的表達，參與AD的發生發展。接下來的功能增益實驗表明，miR-139過表達還可引起Aβ25-35誘導Neuro-2a細胞NF-κB表達上調，發揮Aβ25-35介導的胞毒性和凋亡作用，說明miR-139可通過多種途徑參與AD的發生及發展。

總之，我們證明Aβ25-35顯著上調小鼠Neuro-2a細胞中的miR-139表達、下調FOXO1表達。此外，miR-139可分別通過直接抑制FOXO1、間接激活NF-κB發揮Aβ25-35誘導的神經毒性，從而闡明了miR-139神經毒性的分子機制。探討miR-139作為治療AD的潛在治療靶點的可能性，為預防、診斷以及治療AD提供了新的思路。