通過二代測序技術開發25個小熊貓的微衛星位點

楊艾琳， 謝軍金， 沈富軍， 張文平， 侯蓉， 張志和， 張亮*

(1. 四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都大熊貓繁育研究基地，成都610081；2.北京師范大學，北京100875)

小熊貓Ailurusfulgens是國家Ⅱ級重點保護野生動物，主要分布在喜馬拉雅-橫斷山脈一帶，有2個亞種：指名亞種A.f.fulgens和川西亞種A.f.styani(高耀亭，1987)。自20世紀90年代以來，小熊貓野生種群生存狀況不斷惡化。世界自然保護聯盟(IUCN)紅色名錄在其評估報告中指出，由于棲息地的退化和破碎化，小熊貓野生種群已處于瀕危(EN)狀態(Glatston，2015)。當各隔離的小熊貓小種群面臨長期續存的挑戰時，開展遷地保護，以期復壯未來的野生種群是必要的。同時，這亦是緩解小熊貓野生種群壓力的重要手段之一。如何建立科學的小熊貓圈養種群管理體系，力求實現種群的自我維持，是目前管理者們亟待解決的問題。

根據中國動物園協會2017年的譜系調查，現存圈養小熊貓個體為485只。近年來，國內小熊貓圈養種群的數量持續增長，但遺憾的是，由于缺乏科學的管理體系，很多機構小熊貓種群的管理記錄不僅不完善，甚至還存在一些錯誤記錄。同時，現有的配對方式易導致圈養種群遺傳多樣性丟失，甚至發生近交衰退，最后威脅整個種群的續存。遺傳多樣性對于物種特別是瀕危物種的保持至關重要(Meffe & Carroll，1994)，瀕危物種遺傳多樣性往往較低，而且有效種群也較小，因此易發生遺傳漂變。近交是有共同祖先的個體間的交配(Blouin & Blouin，1988)。遺傳多樣性的丟失和近交的聯合作用會降低種群對環境/氣候變化的適應力，通過近交衰退直接或間接地導致適合度下降(Keller & Waller，2002；Armstrong & Seddon，2008；Jamieson，2011)。保護遺傳學是保護生物學研究中的一個核心部分，主要研究瀕危物種的遺傳多樣性和保護物種的進化潛力(李明等，2001)，加強保護遺傳學方面的研究，及時為圈養種群的管理提供科學指導。

微衛星即簡單重復序列，由相對短片段的隨機重復組成，常常被偶然發現于已經測序過的DNA片段上(Tautz & Renz，1984)。微衛星是脊椎動物基因組的重要組成部分，相比于線粒體DNA和核基因內含子，微衛星具有相對較高的突變率(Ryman & Leimar，2008)，在整個基因組上分布廣泛(Kashietal.，1997)。

微衛星作為一個應用廣泛且十分可靠的分子標記，常常用于解決種群遺傳和進化等問題(Estoup & Angers，1998)，許多瀕危物種的圈養種群管理都采用了微衛星技術，并取得了很好的成效。如Omote等(2012)在毛腿漁鸮Buboblakistoni上開發了8個微衛星位點，在120只個體上進行了擴增，進行遺傳多樣性的分析，等位基因數為2～7，觀察雜合度和期望雜合度分別為0.052～0.742和0.067～0.769；微衛星還可估測現階段的遷移率，具有區分隨機交配和相對高遷移率的能力，并能估計個體之間的相關性(Selkoe & Toonen，2006)；在大熊貓Ailuropodamelanoleuca(Zhangetal.，2003)、華南虎Pantheratigrisamoyensis(Zhangetal.，2012)、丹頂鶴Grusjaponensis(Zhangetal.，2015)等瀕危動物上也得到了很好的應用。

此前，我們已經采用磁珠富集法開發了26個小熊貓微衛星位點(Liangetal.，2007；Zhangetal.，2008)。遺憾的是，由于國內圈養小熊貓種群普遍缺乏科學、詳細的記錄，存在著資料有誤、父/母未知、父母均未知、疑似父母范圍廣等多種問題，在圈養種群遺傳管理的實際工作中，現有位點還不能在復雜情況下很好地完成親緣關系推定，因此，我們決定開發新的微衛星位點，以期提高小熊貓親子鑒定的準確率。

1 研究方法

在成都大熊貓繁育研究基地采集1只2歲雄性小熊貓的血液樣品(本研究所用小熊貓樣品均采自成都大熊貓繁育研究基地)，用血液和組織核酸純化試劑盒(Qiagen，德國)提取DNA后，將總DNA送往上海美吉生物醫藥科技有限公司，通過Roche 454測序平臺的FLX測序儀進行測序。應用Newbler 2.6(Marguliesetal.，2005)進行短片段文庫的拼接，組裝后的數據用misa.pl(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進行微衛星位點分析。

使用PRIMER3(Rozen & Skaletsky，2000)在篩選出的微衛星序列中隨機選擇了467條設計引物?？紤]到滑鏈風險(Edwardsetal.，1991；Taberletetal.，1996，2008)會對微衛星數據的讀取造成影響，本研究所選取的微衛星位點均為3～6堿基重復序列。用這467對引物對5只小熊貓個體進行PCR擴增(Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700，美國)。反應體系為：模板DNA 50 ng，20 μmol·L-1上、下游引物各0.2 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6～1.4 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，Taq酶0.2 U，加水補足至10 μL體系。擴增體系如下：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，退火15 s(退火溫度詳見表1)，72 ℃ 30 s，10個循環；89 ℃ 15 s，退火15 s(退火溫度詳見表1)，72 ℃ 30 s，20個循環；72 ℃ 10 min；最后4 ℃保存。將所有初始引物的PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，選取PCR產物的條帶位于設計的長度范圍內，且條帶清晰、明亮的引物加上熒光標記(6-FAM或HEX)，接下來使用8只小熊貓的DNA樣本，對以上熒光引物進一步篩選。將最后篩選出的引物應用到42只小熊貓個體上進行基因分型。為了確保分型數據的準確性，所有PCR均進行3次重復，基因分型在成都擎科梓熙生物技術有限公司進行。

根據所獲得的分型數據，使用Cervus 3.0(Marshalletal.，2010)進行微衛星位點的遺傳多樣性分析，計算等位基因雜合度和多態信息含量(polymorphism information content，PIC)。另外，使用Genepop 3.4(Raymond & Rousset，2003)進行哈迪-溫伯格平衡、連鎖不平衡以及無效等位基因頻率的檢測。

2 結果與分析

測序共獲得了2.9 Gb的數據量，平均讀長為567.9 bp。N50長度為719 bp，平均GC含量為40.41%，平均測序深度1×。Contigs數目為1 830個，拼接得到了近36萬條序列。經分析得到微衛星序列近8萬條，其中，單堿基重復序列59.2%，二堿基重復序列31.9%，三堿基重復序列4.4%，四堿基重復序列3.8%，五堿基重復序列和六堿基重復序列分別為0.6%和0.08%。

在測序得到的微衛星序列中隨機選擇了一部分，利用Primer 3.0設計了467對引物。經瓊脂糖凝膠電泳，排除多位點擴增及擴增失敗的引物，最后篩選出了25個微衛星位點(表1)，并提交到GenBank數據庫(登錄號：KX609964～609988)。對成都大熊貓繁育研究基地的42只小熊貓進行了基因分型，共獲得了128個等位基因，等位基因數目3(CRP18、CRP391、CRP442)到10(CRP43)，每個位點的平均等位基因數是5.12；PIC=0.128～0.843，平均值為0.596 2；而觀察雜合度和期望雜合度分別為0.143～0.929和0.136～0.869(表1)。經過檢測，所有位點均未偏離哈迪-溫伯格平衡(表1)、無顯著的連鎖不平衡、無無效等位基因。

用這25對微衛星引物對10份以上陳舊樣品(4 ℃放置2年以上的小熊貓血液DNA)進行了PCR擴增。分型結果與新鮮血液DNA結果完全一致，說明這些微衛星引物可應用于較低質量的DNA樣品。

3 討論

PIC是衡量分子標記信息量最常用的指標(Nagyetal.，2012)。根據Botstein等(1980)的標準，本研究中新開發的25個微衛星位點具有很好的重復性和穩定性，其中有19個位點具有高度多態性。所有位點未偏離哈迪-溫伯格平衡和連鎖不平衡，提示它們適合用于小熊貓種群的遺傳多樣性及遺傳結構分析。今后我們將以這25個位點為主，加上此前開發的優質位點，進一步擴大樣品數量，建立成都大熊貓繁育研究基地小熊貓種群乃至國內種群的微衛星數據庫。

中國的小熊貓圈養種群管理并不完善，存在的歷史問題比較多，例如譜系比較混亂、繁殖配對隨意等。此外，考慮到國內圈養小熊貓機構間存在一定的交換，在全國范圍內開展一次親緣關系普查是必要的。本研究中報道的微衛星位點可以對圈養種群個體之間的親緣關系進行分析和驗證，建立科學的譜系關系，從而避免近親配對等不科學的管理方式，也對小熊貓將來的就地保護和遷地保護具有重要意義。