TMEM16A氯通道對心肌缺血再灌注后損傷大鼠乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶的影響

蘇振宇 黃建成 董彥博 李小兵 張會軍

(河北醫科大學第一醫院心外科，河北 石家莊 050031)

心肌缺血再灌注后損傷的具體發病機制還不明確，是多種因素相互作用的結果〔1，2〕。減少心肌細胞內鈣超載是防治再灌注損傷的重要環節，Ca2+也是調節心肌細胞收縮和舒張所必需的因素，心肌細胞內游離鈣濃度〔(Ca2+)i〕維持在一定范圍方能保證心肌正常功能〔3〕。成熟心肌〔(Ca2+)i〕主要靠肌漿網的釋放與隔離作用來調節。而未成熟心肌的肌漿網稀疏、質膜面積和細胞容積比值大，鈣泵活性低〔4，5〕。為此在心肌缺血再灌注后中使用鈣通道阻斷劑使細胞外鈣內流減少，可減輕細胞內鈣超載，對心肌有保護作用〔6，7〕。鈣激活氯通道(CaCCS)在組織中分布廣泛，包括血細胞、上皮細胞、內皮細胞中，可參與腺體和上皮分泌、感覺傳導、細胞增殖、神經和心肌興奮性調節、細胞分裂周期等〔8，9〕。跨膜蛋白(TMEM)16A為鈣激活氯通道的分子基礎，在腫瘤組織中明顯表達上調〔10，11〕，但是對心肌酶的影響還無相關報道。本文探討TMEM16A氯通道對心肌缺血再灌注后損傷大鼠乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的影響。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 出生1～3 d的SD大鼠20只，由河北醫科大學第一醫院動物實驗中心提供。MEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG購自華美生物工程有限公司，羊抗兔一抗〔蛋白激酶B(Akt)、β-actin等〕購自Cell Signaling公司，LDH和CK-MB檢測試劑盒購自Sigma公司。

1.2心肌細胞分離與培養 SD大鼠消毒，開胸取出心臟，放入預冷無菌的D-Hank液中，用無菌剪刀剪開心臟，采用D-Hank液沖洗血液。再采用無菌剪刀將心室肌剪成1 mm3大小的組織塊，加入胰蛋白酶消化5～10 min，取上層混懸液。繼續加入新鮮的胰蛋白酶10 ml消化5～10 min，移棄上清。加入含15%胎牛血清的MEM培養基10 ml，4℃下離心(1 000 r/min，離心半徑10 cm)，過200目孔徑不銹鋼進行網篩。心肌細胞培養鑒定標準：倒置顯微鏡下細胞呈放射狀，細胞核呈橢圓形，細胞呈片狀有節律搏動。

1.3實驗分組 心肌細胞分為4組，A組：陰性對照組：于常氧條件下培養心肌細胞3 h；B組：陽性對照組：灌注組，心肌細胞未經任何處理，采用缺氧2 h、復氧1 h進行心肌缺血再灌注處理。C組：激活組，采用TMEM16A氯通道激活劑1 mmol/L預處理20 min，再進行心肌缺血再灌注處理；D組：抑制組，采用TMEM16A氯通道抑制劑1 mmol/L預處理20 min，再進行心肌缺血再灌注處理。

1.4檢測指標 (1)細胞活性測定：將心肌細胞接種于96孔培養板，吸棄培養基，每孔加入5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 μl，培養4 h后棄MTT液，每孔加入二甲基亞砜100 μl，震蕩20 min后，選擇結晶紫溶解后，于490 nm下檢測吸光度值，計算細胞活性。(2)活性氧(ROS)水平測定：心肌細胞接種于6孔板，加入100 μl終濃度為10 μmol/L的二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-CA)覆蓋細胞，然后與DCFH-CA探針混合，37℃度培養30 min，PBS洗滌3次，采用流式細胞儀檢測細胞內的熒光強度，檢測波長520 nm，熒光強度與細胞內產生的ROS量呈正比。(3)Western印跡法：分析活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)-3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt的表達水平，實驗結束后，倒掉培養液，PBS洗滌細胞2次，取細胞，至EP管中，離心(12 000 r/min，4℃)5 min，將上清轉移至另一EP管中作為蛋白原樣，進行Western印跡分析。讀取目的條帶的光密度掃描值，以β-actin條帶作為內標，取相對表達量。(4)CK-MB活性、LDH活性測定：CK-MB活性(U/ml)=〔7.449 1×(測定OD-測定空白OD)-0.071 6〕×樣本測試前稀釋倍數。LDH活性(U/L)=(OD測定管-OD對照管)/(OD標準管-OD空白管)/50%×反應液的總體積，所有實驗重復3次。

1.5統計方法 采用SPSS22.00軟件行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1心肌細胞特性 心肌細胞剛接種后細胞呈球形懸浮在培養液中；培養4～6 h后開始貼壁生長；培養12～24 h細胞基本貼壁，自發性搏動頻率為(40～80)次/min；培養2 d后細胞收縮明顯而有力，同步節律性搏動頻率為(90～120)次/min。

2.2細胞存活率、CK-MB與LDH活性對比 實驗前各組細胞存活率均在95%以上，實驗結束后A、B、C、D組的細胞存活率對比差異有統計學意義(P<0.05)。B、C、D組的CK-MB與LDH活性都高于A組(P<0.05)，D組的CK-MB與LDH活性低于B組、C組(P<0.05)。見表1。

表1 4組細胞存活率、CK-MB與LDH 活性對比

與A組對比：1)P<0.05；與B組對比：2)P<0.05；與C組對比：3)P<0.05，下表同

2.3ROS水平對比 B、C組的ROS水平(121.43±18.4、188.93±32.91)顯著高于A組(20.48±3.20，P<0.05)，D組的ROS水平(43.20±2.22)與B、C組相比顯著減少(P<0.05)，但是與A組相比依然有統計學差異(P<0.05)。

2.4cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表達對比 B、C組的cleaved caspase-3、p-Akt相對表達水平高于A組(P<0.05)，D組與A組相比差異無統計學意義(P>0.05)，4組Akt相對表達水平對比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組細胞cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表達

組別cleaved caspase-3p-AktAktAkt/p-AktA組0.45±0.140.10±0.040.78±0.217.84±2.42B組0.63±0.121)0.37±0.121)0.76±0.172.19±0.421)C組0.78±0.311)2)0.58±0.141)2)0.78±0.191.45±0.321)2)D組0.53±0.082)3)0.08±0.032)3)0.77±0.5310.87±3.222)3)F值4.78311.5210.2318.142P值<0.05<0.05>0.05<0.05

3 討 論

從機制上分析，心肌缺血時，心肌得不到氧及底物供應，可造成心肌形態結構、功能的急劇變化，為此需要迅速恢復缺血組織的血供，但是長時間缺血的心肌恢復灌流時組織損傷及器官功能障礙反而加重〔12，13〕。已有研究表明心肌缺血再灌注后損傷與氧自由基、血管無復流、鈣超載、白細胞等多種因素，也不是單一因素造成的，而是許多環節共同作用的結果〔14〕。

基礎研究表明TMEM16A沉默能引起內源性CaCCs功能的抑制，表達異源的TMEM16A有CaCCs生理和藥理學特征，獨立構成了CaCCs或與其他未知蛋白共同構成了CaCCs〔15〕。TMEM16A氯通道在正常情況基本處于關閉狀態，當細胞缺氧、三磷酸腺苷(ATP)減少時促進氯通道開放，TMEM16A氯通道開放可以發揮加重心肌缺血再灌注損傷的作用，阻斷TMEM16A氯通道則心肌缺血預適應的保護作用恢復〔16〕。有研究表明TMEM16A氯通道屬于終末效應器〔17〕，但有學者認為TMEM16A氯通道是啟動因子〔18〕。心肌缺血再灌注時，大量的ROS呈現爆發性生成，從而造成ROS在體內積聚。ROS可以使大量的白細胞在心肌毛細血管聚集并活化，增強中性粒細胞的趨化性，引起心肌微血管的阻塞。TMEM16A氯通道抑制劑可有利于降低ROS活動，對心肌缺血再灌注后損傷有良好的防治作用〔19，20〕。

心肌缺血再灌注后損傷后，多種內源性物質釋放，如降鈣素基因相關肽、內皮素、內啡肽等通過相應信號轉導，引起離子通道改變，但是具體機制還不明確。最近研究表明TMEM16A氯通道對心肌產生保護作用，已在培養的大鼠及人心房心肌細胞得到證實〔21〕。LDH和CK-MB為反映心肌功能的常見指標，在診斷再灌注后損傷時有一定價值〔22〕。LDH和CK-MB高表達可直接損傷血管內皮細胞，使其通透性增高，破壞血凝-抗血凝平衡，促進血栓形成〔23〕。LDH和CK-MB還可刺激血管平滑肌細胞向血管內皮下浸潤、聚集和增生，使血管平滑肌細胞收縮較弱，肌動蛋白合成減少，從而促進動脈粥樣硬化形成〔24〕。基礎研究表明CaCCs可激活導致膜去極化或復極化，鈣調蛋白的敏感性異常，使鈣通道磷酸化時間延長，導致蛋白磷酸酶活性顯著下降，導致鈣內流增加，也誘導了TMEM16A氯通道開放〔25〕。TMEM16A氯通道抑制劑可抑制電位依賴的Ca2+內流，擴張全身阻力血管和容量血管，從而抑制CK-MB與LDH活性，舒張小冠狀動脈和阻力血管，增加冠狀動脈血流，降低心臟前后負荷和心肌耗氧量。

心肌缺血再灌注后損傷的調節過程涉及多條細胞內外信號轉導通路〔26〕。活化的cleaved caspase-3被上游的凋亡始動子激活后可以作用于特異性底物，可誘導細胞凋亡。cleaved caspase-3激活后與可裂解一系列細胞內骨架蛋白及細胞修復酶等，改變細胞結構，激活核酸內切酶將染色質切割，使細胞骨架蛋白、細胞外基質蛋白降解，裂解或失活DNA修復相關分子〔27〕。本研究表明TMEM16A氯通道抑制劑可通過降低cleaved caspase-3、p-Akt水平從而對再灌注后心肌損傷起到保護作用。也有研究表明TMEM16A氯通道關閉能導致細胞膜超級化和動作電位時間縮短與鈣內流降低有關，并能保護心肌于缺血時鈣超載所致的不可逆損害〔28〕。