PI3k/AKT信號(hào)通路在老年大鼠乳腺癌血管形成中的作用及對(duì)整合素連接激酶ILK的抑制效果

曲義坤 國(guó)麟祺 夏偉濱 徐劍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154002)

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，患者死亡率較高，近年來臨床上呈現(xiàn)出顯著上升趨勢(shì)〔1〕。研究人員發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路在腫瘤當(dāng)中存在失調(diào)問題，這一通路的成分突變會(huì)影響到通路功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，一方面能夠刺激腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增殖，另一方面還會(huì)加速腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲。所以PI3K/Akt信號(hào)通路成為臨床研究的熱點(diǎn)問題，將這一信號(hào)通路當(dāng)作關(guān)鍵靶點(diǎn)的乳腺癌靶向治療受到人們的高度重視〔2～4〕。本研究分析老年大鼠乳腺癌血管形成中PI3K/AKT蛋白表達(dá)情況對(duì)整合素連接激酶(ILK)的抑制效果。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選擇老年大鼠30只，設(shè)為對(duì)照組；另外選擇老年大鼠30只，建立老年大鼠乳腺癌動(dòng)物模型，設(shè)為觀察組。入組60只老年大鼠檢疫合格，體重30～68〔平均(45.2±1.3)〕g，12～18周齡，平均(15.1±0.3)w。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2007-0003，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。本研究經(jīng)過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立 30只參與建模的老年大鼠，適應(yīng)性1 w喂養(yǎng)后，將化學(xué)致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)10 mg一次性灌胃后第2天開始，按照5 d為1個(gè)周期進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)干預(yù)12 w；第1～3天每天腹腔注射苯甲酸雌二醇(北京麥迪海藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H200000701)0.5 mg/kg，第4天腹腔注射黃體酮(上海現(xiàn)代制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022328)4 mg/kg，停藥1 d，從而完成老年大鼠卵巢癌動(dòng)物模型建立。

1.2.2檢查方法 (1)PI3K蛋白表達(dá)陽性率。①觀察組建模成功后以斷頸方式處死，取乳腺病灶組織，對(duì)照組同樣以斷頸方式處死，常規(guī)取乳腺組織。向選取的乳腺組織中加入蒸餾水與濃度為30.0%過氧化氫(H2O2)，常溫下加入內(nèi)源性酶并進(jìn)行10 min滅活，磷酸鹽緩沖液(PBS)連續(xù)洗滌3次。將最終獲得的切片放置在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液pH最終為6。電爐加熱直到煮沸，5 min間隔后再次煮沸，常溫下冷卻。采用PBS洗滌2次，每次5 min，最后加入5%胎牛血清(BSA)封閉液并加入兔抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，兔抗人PI3K、Akt蛋白一抗，1滴。滴加完畢后進(jìn)行3次PBS洗滌；在1 ml底物中加入兔抗人PI3K、Akt蛋白二抗1滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復(fù)染后封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，每份標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值；②判斷方法。參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別從細(xì)胞的陽性數(shù)量(陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分)、染色強(qiáng)度(不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分)完成免疫組化染色評(píng)分，總分16分，分?jǐn)?shù)越高，陽性率越高。(2)記錄并統(tǒng)計(jì)觀察組大鼠病理資料，包括：腫瘤直徑、組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分析不同病理資料下PI3K蛋白陽性率。(3)PI3K/Akt信號(hào)通路及ILK表達(dá)。采用Western印跡法測(cè)定軟骨組織中PI3K/Akt信號(hào)通路及ILK表達(dá)水平。取兩組乳腺組織，放入含有液氮的研磨器中研磨成粉末。向勻漿器中加入RIPA組織裂解液500 μl，待組織充分裂解后移到EP離心管1.5 ml中，10 min離心，離心速度12 000 r/min，離心完畢后留取上清，利用蛋白質(zhì)定量試劑盒完成蛋白濃度測(cè)定并將其放置在-80℃冰箱。精確稱取待測(cè)樣品30 μg，加入6倍上樣緩沖液，煮沸5 min使得蛋白充分變性，取上層清液，轉(zhuǎn)移到EP管中，放入-20℃冰箱中，備用。對(duì)蛋白組織進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜后加入兔抗人PI3K/Akt信號(hào)通路及ILK一抗，4℃下孵育過夜后進(jìn)行3次PBS清洗，加入二抗，常溫下1 h振蕩，3次清洗，每次10 min，加入顯色液，在Tanon5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠PI3K蛋白及Akt蛋白表達(dá)陽性率比較 觀察組PI3K蛋白(76.67%)及Akt蛋白(83.33%)表達(dá)陽性率顯著高于對(duì)照組(16.67%，10.00%，χ2=6.892,P=0.029;χ2=5.718，P=0.031)。

2.2觀察組大鼠不同病理下PI3K蛋白表達(dá)陽性率比較 觀察組PI3K蛋白及Akt蛋白表達(dá)陽性率與性別無相關(guān)性(P>0.05)；觀察組老年乳腺癌大鼠中PI3K蛋白及Akt蛋白表達(dá)陽性率在不同腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組大鼠不同病理下PI3K及 Akt蛋白表達(dá)陽性率比較(n)

2.3兩組PI3K/Akt信號(hào)通路及ILK表達(dá)比較 觀察組PI3K/Akt信號(hào)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組乳腺癌大鼠ILK信號(hào)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 兩組PI3K/Akt信號(hào)通路及ILK表達(dá)

3 討 論

PI3K是生物細(xì)胞膜必不可少的組成部分之一，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)分子參與到細(xì)胞調(diào)節(jié)的過程。PI3K對(duì)于激活腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及抗凋亡等領(lǐng)域，都有著一定程度的影響〔5〕。PI3K家族的研究較多，根據(jù)其結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)一步分成Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型，每型又能夠進(jìn)一步分成不同亞型。目前，研究最為普遍的是可以被細(xì)胞受體激活的PI3KⅠ型，包括ⅠA及ⅠB兩個(gè)亞型〔6〕。ⅠA型PI3K是催化亞基P110及P85聯(lián)合組成的異二聚體。PI3K能夠同連接蛋白以及生長(zhǎng)因子受體互相作用，從而改變二聚體構(gòu)象將其激活。PI3K還能夠同Ras蛋白及P110的結(jié)合，激活結(jié)果是在質(zhì)膜上生成PIP3，PIP3同細(xì)胞當(dāng)中的信號(hào)蛋白Akt及磷酸肌醇蛋白激酶(PKD)1進(jìn)行結(jié)合，Akt還可以借助于PKD2(例如ILK)對(duì)其磷酸化誘發(fā)的Akt徹底活化〔7〕。只有Akt的Thr307及Ser473都徹底磷酸化之后才可以有效發(fā)揮功能。Akt是蘇氨酸激酶的一種，包括480個(gè)氨基酸殘基，同蛋白激酶(PK)A及PKC高度同源，屬于主要的PI3K下游效應(yīng)分子〔8〕。Akt分子的氨基酸結(jié)果方面主要包括催化結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域及羧基端結(jié)構(gòu)域。其中PH結(jié)構(gòu)域包括氨基酸殘基100個(gè)，能夠介導(dǎo)Akt活化之后的膜轉(zhuǎn)位〔9〕。催化結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包括ATP位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的Thr308的磷酸化是Akt活化必不可少的。目前研究人員發(fā)現(xiàn)Akt成員包括Akt1/PKBa、Akt3/PKBg及Akt2/PKBb 3種不同的亞型，包括3種不同的基因編碼，不過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，在各種器官組織當(dāng)中廣泛表達(dá)。Akt激活之后，從細(xì)胞膜逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，能夠借助于磷酸化抑制或者是激活下游靶蛋白，從而影響到細(xì)胞凋亡、增殖或者是遷移〔10〕。PI3K/Akt信號(hào)通路受各種因素的影響，負(fù)反饋主要由染色體丟失性的蛋白抑癌基因，阻斷Akt及效應(yīng)分子的活化。本研究結(jié)果提示PI3K/Akt同老年大鼠乳腺癌血管生成有重要的影響。檢測(cè)乳腺癌組織以及正常乳腺組織當(dāng)中的PI3K/Akt表達(dá)水平，并且分析其同臨床病理指標(biāo)間的聯(lián)系，可以為乳腺癌早診斷以及早治療提供參考依據(jù)〔11〕。

PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑能夠在一定程度上抑制VEGF生成與分泌，還能給抑制血管的增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路可以激活A(yù)kt，后者則可以激活底物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)，磷酸化mTOR并且借助于失活結(jié)節(jié)性復(fù)合物2(TSC2)來加速mTOR磷酸化〔12〕。PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑能夠防止因?yàn)閙TOR抑制而出現(xiàn)的Akt激活，有著重要的應(yīng)用價(jià)值。LY294002及青霉素是常規(guī)的PI3K/Akt通路抑制劑，能夠抑制PI3K通路P110亞基活性，從而阻斷信號(hào)通路，抑制腫瘤血管增殖及腫瘤生長(zhǎng)，不過因?yàn)槎拘暂^強(qiáng)而影響到臨床應(yīng)用〔13〕。雷帕霉素是新出現(xiàn)的一種mTORC1抑制劑，能夠在抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的過程當(dāng)中同時(shí)抑制血管生成及細(xì)胞增殖。同雷帕霉素比較而言，0SI-027及OXA-I能夠發(fā)揮雙重抑制效果，所以PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑同VEGF抑制劑聯(lián)合使用可以發(fā)揮腫瘤血管形成的抑制效果〔14〕。ILK是一個(gè)有著3個(gè)結(jié)構(gòu)單位的蛋白激酶，并且在N端有著4個(gè)重復(fù)的錨蛋白序列，接下來是磷酸肌醇基序，C端則是整合素的結(jié)合位點(diǎn)〔15〕。ILK活性程度受H3K活性水平的影響，推測(cè)其調(diào)控作用機(jī)制是H3K的生成物PIP3可以借助于磷酸肌醇結(jié)合基序來同ILK實(shí)現(xiàn)結(jié)合〔15〕。活化之后的ILK磷酸化蛋白激酶(pPK)B與糖原合成酶激酶(GSK)3能夠使它們激活同時(shí)發(fā)揮生物學(xué)作用。乳腺癌組織當(dāng)中的ILK呈現(xiàn)為棕黃色的顆粒，定位在腫瘤的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜當(dāng)中，同時(shí)陽性物質(zhì)集中分布在腫瘤細(xì)胞，部分分布在腫瘤問質(zhì)，間質(zhì)當(dāng)中主要是成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的著色〔16〕。乳腺癌當(dāng)中的ILK表達(dá)同組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性。ILK蛋白在乳腺癌組織當(dāng)中的表達(dá)要顯著高于癌前病變組織，表明ILK同乳腺癌病情的發(fā)生發(fā)展存在不容忽視的重要聯(lián)系，可以刺激乳腺癌的轉(zhuǎn)移以及侵襲〔17〕。ILK在人類的肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌及黑色素瘤等組織當(dāng)中均呈現(xiàn)為高表達(dá)，并且表達(dá)程度同惡性程度存在顯著正相關(guān)〔18〕。ILK高表達(dá)細(xì)胞在培養(yǎng)過程當(dāng)中并不貼壁生長(zhǎng)，能夠抑制懸浮細(xì)胞的凋亡，在裸鼠當(dāng)中成瘤ILK借助于Ser473來激活PKB，從而影響到細(xì)胞的正常死亡〔19〕。PKB抑制細(xì)胞的死亡是借助于一系列的效應(yīng)物實(shí)現(xiàn)的，主要包括磷酸化的bcl-2及失活的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)9。借助于過磷酸化還可以抑制forkhead轉(zhuǎn)錄因子及FAS配體表達(dá)。活化之后的PKB磷酸化Ser9能夠抑制GSK3活性程度使得細(xì)胞核當(dāng)中的cyclinD1持續(xù)累積，從而刺激細(xì)胞周期進(jìn)行。借助于抑制GSK3活性可以降低13-連接蛋白的降解。GSK3的下游效應(yīng)物是AP-1轉(zhuǎn)錄因子的組成元件，GSK3雖然可以對(duì)其DNA結(jié)構(gòu)域磷酸化，使其無法順利同DNA進(jìn)行結(jié)合。對(duì)GSK3活性程度的抑制影響到磷酸化進(jìn)程，誘導(dǎo)凋亡蛋白(AP)-1活性。研究人員發(fā)現(xiàn)，GSK3活性是細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)依賴ILK及PI3K來發(fā)揮抑制效果的，與此同時(shí)，這種抑制對(duì)于胞外基質(zhì)的AP-1活性也有重要的影響〔20〕。細(xì)胞及胞外基質(zhì)之間的互相影響誘導(dǎo)ILK活性，ILK則可以抑制GSK3活性水平。GSK3活性的降低刺激AP-1啟動(dòng)子序列結(jié)合，活化AP-1轉(zhuǎn)錄因子。本研究結(jié)果提示，ILK抑制對(duì)于影響老年大鼠乳腺癌血管細(xì)胞有顯著的效果。