蠶蛹油對慶大霉素致大鼠腎臟損傷的保護作用

周靜 曾艷 楊柳 張莉 羅來敏 魏昕 王瑜 李秋月 程斌

(1南昌大學第一附屬醫院腎內科，江西 南昌 330006；2浙江醫藥高等專科學校)

慶大霉素是一種氨基多糖體的抗生素，主要用來對抗革蘭陰性菌的感染；然而，在臨床上常會產生腎毒性等副作用。氧化性壓力可能與慶大霉素造成的腎毒性有關〔1～3〕。蠶蛹油脂中含有大量不飽和脂肪酸甘油酯，在體內能水解為人體必需的油酸、亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸。蠶蛹油具有增加生物膜液體性、舒張血管、抗血栓形成、降低血漿總膽固醇、抗血小板聚集等藥理作用。本研究主要探討蠶蛹油對慶大霉素引起大鼠腎臟傷害的保護作用。

1 材料與試劑

1.1動物 SD大鼠70只，雌雄過半，體重(200±50)g，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號0012051。飼養室溫控制在25℃，相對濕度為75%；每只實驗動物自由飲水，喂飼普通飼料。

1.2實驗試劑及儀器 蠶蛹油(江蘇南通福爾生物)；慶大霉素(福建古田藥業)；尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)試劑盒(寧波美康)；丙二醛(MDA)-586測定試劑盒(美國OXIS)；甲醇(Merck)；鹽酸(Merck)；乙醚(Merck)；格里斯試劑(Griess reagent,Sigma)；乙二胺四乙酸(EDTA)；羥吲哚βD葡萄糖苷酸(indoxyl βD-glucuronide,Sigma)；3-氨基苯二甲酰肼(luminol,Sigma)；硝酸雙-N-甲基吖啶翁(Lucigenin,Sigma)；Tris-HCl(Merck) 。

DRII-CHEM 3500s血液生化分析儀(日本Fujifilm)；CX21BIM-SET6光學顯微鏡(奧林巴斯)；CLA-2100高效能化學發光分析儀(日本Tohoku)；Micro21/21R離心機(美國Thermo)；ESB-500室高剪切均質乳化機(上海易勒機電)；G9雙光束紫外可見分光光度計(美國菲勒)。

1.3方法

1.3.1動物分組及給藥 70只SD大鼠分成7組，每組10只。第1組為正常組，大鼠每天按照1 ml/kg皮下注射去離子水，同時按照1 ml/kg灌胃給予去離子水，連續1 w。第2組為模型組，大鼠每天按照100 mg/kg皮下注射慶大霉素，連續1 w。第3～7組為給藥組，大鼠每天按100 mg/kg皮下注射慶大霉素，同時灌胃給予0、1、2、4、8 ml/kg劑量的蠶蛹油，連續1 w。

1.3.2指標檢測 給藥末日當晚禁食不禁水12 h，次日上午，各組大鼠乙醚麻醉后，從股靜脈抽取1.5 ml血液并放入血清分離管中，靜置30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上層血清。采血后，迅速取出腎臟，生理鹽水清洗后，立刻在室溫下浸泡在4%的甲醛中固定，供腎組織病理學檢查用。

1.3.2.1血生化指標 BUN及CREA為腎功能的評估指標，采用全自動血液生化分析儀進行分析。

1.3.2.2腎臟脂質過氧化檢測 取約200 mg腎臟，0.9%生理鹽水沖洗，加Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH7.4)進行均質化，4℃ 12 000 r/min離心30 min。吸取200 μl上層液，按MDA-586測定試劑盒說明書進行MDA含量分析，586 nm波長處測量其吸光值。

1.3.2.3腎臟中羥自由基、過氧亞硝酸鹽及超氧陰離子含量測定 取約200 mg大鼠腎臟，加入Tris-sucrose緩沖液(0.25 mol/L蔗糖溶液加入到含1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH7.4)進行均質，4℃ 12 000 r/min離心30 min。取400 μl 上清液與 200 μl 生理鹽水混合后置入化學發光分析儀中分析，分別注入17 mmol/L indoxyl βD-glucurinide和luminol各100 μl，測量羥自由基、過氧亞硝酸鹽及超氧陰離子含量，用化學發光分析儀數據采集軟件(CLA-DAS) 計算待測樣品含量。

1.3.2.4腎臟中一氧化氮(NO)含量測定 取約200 mg大鼠腎臟，加去離子水進行均質，4℃ 12 000 r/min離心30 min；取100 μl 組織上清液與100 μl Greiss reagent(40 mg/ml)混合，然后加入800 μl 的去離子水；550 nm波長處測量該樣品之吸光值，計算NO含量。

1.3.2.5腎臟病理檢測 將固定好的腎組織HE染色后，在光學顯微鏡下觀察腎組織病理情況，評分標準：細胞浸潤得1分、喪失邊緣絨毛得1分、細胞質空泡化得1分、細胞腫脹得1分、細胞壞死得2分。 至少觀察10個視野以客觀紀錄組織傷害嚴重程度。根據上述評分標準計分，得分越高表示傷害程度越高。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0統計學軟件行ANOVA分析。

2 結 果

2.1各組血生化指標水平比較 與正常組相比，模型組的血清BUN及CREA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低血清BUN及CREA水平(P<0.05)。見表1。

2.2各組腎臟脂質過氧化水平比較 與正常組相比，模型組的腎臟MDA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～4 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟MDA水平(P<0.05)。見表1。

2.3各組腎臟中羥自由基含量測定 與正常組相比，模型組腎臟中羥自由基的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中羥自由基的含量(P<0.05)。見表1。

2.4腎臟中過氧亞硝酸鹽含量測定 與正常組相比，模型組腎臟中過氧亞硝酸鹽的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中過氧亞硝酸鹽的含量(P<0.05)。見表1。

2.5腎臟中超氧陰離子和NO含量測定 與正常組相比，模型組腎臟中超氧陰離子和NO的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中超氧陰離子含量，差異有統計學意義(P<0.05)。蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1雖然能降低腎臟中NO的含量，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.6腎臟病理檢測 腎組織病理切片結果顯示，慶大霉素會造成大鼠腎臟中腎小管的壞死，而腎小球沒有任何異常。正常組大鼠腎臟中呈現較完整的腎小管形態，模型組大鼠可以明顯找到腎小管的病變區域(箭頭處)，而各劑量蠶蛹油給藥組沒有顯著的腎小管病變。將損害程度給予評分之后，給予蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1處理，其得分均顯著低于模型組(P<0.05)，表示蠶蛹油能夠有效降低慶大霉素造成的大鼠腎臟組織損傷。見表1和圖1。

表1 各組血BUN、CREA水平及腎臟MDA、羥自由基、過氧亞硝酸鹽、超氧陰離子、NO含量及腎組織病理評分比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

Ⅰ：正常組；Ⅱ：模型組；Ⅳ～Ⅶ：蠶蛹油1、2、4、8 ml·kg-1·d-1組圖1 蠶蛹油對各組大鼠腎組織病理的影響(×400)

3 討 論

本實驗探討了蠶蛹油對慶大霉素致腎臟傷害的保護作用，結果顯示，每天給予一定劑量的蠶蛹油可減緩慶大霉素造成的腎臟傷害。本實驗結果表明，蠶蛹油能減少腎臟中羥自由基、過氧亞硝酸鹽、超氧陰離子及一氧化氮的生成。羥自由基及過氧亞硝酸鹽在脂質過氧化反應及器官衰竭中扮演相當重要的角色〔4，5〕。羥自由基會攻擊多元不飽和脂肪酸，使細胞產生氧化連鎖反應，是造成氧化性傷害的重要物質。羥自由基及過氧亞硝酸鹽可能是慶大霉素引發氧化性傷害的關鍵因子；又由于羥自由基可以借由過氧亞硝酸鹽分解而來，所以，推測蠶蛹油也可因為抑制過氧亞硝酸鹽的形成，進而降低脂質過氧化反應。而過氧亞硝酸鹽又是由超氧陰離子及NO不斷反應所產生〔6〕,所以蠶蛹油也可能因為抑制NO及超氧陰離子生成，進而減少過氧亞硝酸鹽含量。

本研究發現，灌食大鼠低劑量的蠶蛹油(2、4 ml·kg-1·d-1)能產生明顯的抗氧化作用，而高劑量的蠶蛹油(8 ml·kg-1·d-1)作用不明顯。蠶蛹油含有極豐富的多元不飽和脂肪酸，雖然多項研究表明多元不飽和脂肪酸是構成細胞膜及維持身體功能的主要物質之一〔7〕，可以調節免疫反應并具有抗炎作用〔8〕，然而多元不飽和脂肪酸本身也是最容易被自由基攻擊而產生過氧化反應的物質〔9〕；且經過研究證實，體內累積太多多元不飽和脂肪酸可能會增加氧化性壓力〔10，11〕。因此，當大鼠經慶大霉素誘導而產生氧化性壓力時，灌食高劑量的蠶蛹油，其中多元不飽和脂肪酸也是受到氧化性攻擊的主要目標物質。所以，體內累積過多的多元不飽和脂肪酸，反而會增加脂質過氧化反應。因此，蠶蛹油的使用并不是越多越好，在安全劑量下使用蠶蛹油才能有效降低氧化壓力，進而減緩腎臟的傷害，大量使用并不會帶來更好的效果。本實驗結果為臨床上使用蠶蛹油提供了參考的劑量，故建議臨床使用時劑量應設定閾值。