黃芪多糖對鎘染毒大鼠免疫功能損傷及氧化應激損傷的保護作用

安方玉 顏春魯 劉永琦 伍志偉 蘇韞 高軍太

(1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室；3平?jīng)鍪兄嗅t(yī)醫(yī)院)

當前，隨著工業(yè)的發(fā)展，金屬鎘污染逐漸成為威脅人類健康的重要危險因素之一〔1〕。因此，對鎘污染造成機體多器官多系統(tǒng)的損傷也備受關注〔2〕。有相關研究報道，鎘污染機體后會造成脂質(zhì)過氧化損傷和免疫損傷〔3,4〕，但具體機制未明。黃芪作為甘肅的道地藥材，有大量研究證實，其具有良好的抗氧化、增強機體免疫力等功能〔5～8〕。為此，本實驗建立大鼠鎘染毒模型，通過觀察黃芪提取物黃芪多糖對染鎘大鼠免疫功能及氧化功能的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級Wistar大鼠36只，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001-0001344。

1.2主要試劑 氯化鎘(天津市巴斯夫化工有限公司，批號：20081010)；羧甲基纖維素鈉 (天津市大茂化學試劑廠，批號：110311)；考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140309)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：20160621、20160627、20160820、20160721、20160728)；鼠白細胞介素(IL)-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為20160718A和201600721A)。

1.3實驗藥物及給藥劑量 藥材選用甘肅地道藥材黃芪，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心藥物制劑實驗室提取、分離、鑒定(純度達到50%以上)。黃芪多糖給藥量：20 mg/kg，用0.5%的羧甲基纖維素配成所需濃度(2 mg/ml)(批號：GR20120920AS2)。

1.4主要儀器 全自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司，型號iMark)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司，型號FA2004N)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產(chǎn)品)；T6新悅-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司)。

1.5動物分組、造模及給藥 SPF級Wistar大鼠36只，雌雄各半，體重(180±20)g，適應性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機數(shù)字表法分為3組：空白對照組、模型組、黃芪多糖組。每組12只。 空白對照組腹腔注射0.9%NaCl，模型組和黃芪多糖組均腹腔注射0.1%氯化鎘，按1.5 mg/kg注射，相當于1.5 ml/kg，每周5次，共5 w。染毒的同時給予黃芪多糖(20 mg·kg-1·d-1)灌胃治療，每天1次，連續(xù)5 w。末次給藥后，取血，脾臟、胸腺備用。

1.6鎘染毒大鼠體重及免疫器官指數(shù)的測定 末次給藥24 h后，稱量大鼠體重，股動脈采血處死大鼠，摘取脾臟、胸腺等組織稱重，分別計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.7脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 常規(guī)制備脾淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml，設立Con A 刺激組和對照組。Con A 刺激組和對照組均加入100 μl脾細胞懸液，其中Con A 刺激組加入10 μl Con A(終濃度為5 μg/ml)，對照組加入10 μl含血清 RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。每孔加入10 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心、棄上清，每孔加入150 μl DMSO裂解液溶解，振蕩混勻。于570 nm處讀取各孔OD值，計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值和刺激指數(shù)(SI)。淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值=(實驗組孔OD值-對照組孔OD值)，SI=實驗組孔OD值÷對照組孔OD值×100%。

1.8NK細胞殺傷活性檢測 常規(guī)制備脾淋巴細胞懸液，調(diào)脾細胞濃度為2×106/ml，K562細胞濃度為1×105/ml，設立對照組和靶細胞組。對照組和靶細胞組均每孔加入 50 μl K562 細胞懸液，培養(yǎng)1 h后，靶細胞組每孔加入50 μl脾細胞懸液，對照組每孔加50 μl完培。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，每孔加入10 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心、棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩混勻。測定570 nm處各孔的A值，計算NK殺傷率。NK殺傷率=〔(靶細胞A值-對照組A值)÷靶細胞A值×100%〕。

1.9脾臟白細胞介素(IL)-2和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1含量的測定 ELISA法測定脾臟IL-2及TGF-β1的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.10脾臟SOD活性和MDA含量的測定 制備脾臟勻漿液，1 500 r/min離心，15 min，取上清，比色分析法測定脾臟抗氧化酶SOD活性和氧化產(chǎn)物MDA的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.11血清AST、ALT、LDH活性的測定 大鼠末次給藥24 h后，動脈采血5 ml，注入試管內(nèi)，靜置2 h，3 000 r/min離心，10 min，分離血清，比色分析法測定血清中AST活性、ALT活性和LDH活性，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.12統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1黃芪多糖對鎘染毒大鼠體重、胸脾指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠體重、胸脾指數(shù)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠體重、胸脾指數(shù)顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組體重、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)比較

與空白對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

2.2黃芪多糖對鎘染毒大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力及刺激指數(shù)(SI)顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力及SI顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值及SI比較

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

2.3黃芪多糖對鎘染毒大鼠NK細胞殺傷活性的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠NK細胞殺傷活性明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠NK細胞殺傷活性顯著增加(P<0.01)。見表3。

2.4黃芪多糖對鎘染毒大鼠脾臟IL-2和TGF-β1含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠脾臟組織IL-2含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組脾臟組織大鼠IL-2含量顯著增加，TGF-β1含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.5黃芪多糖對鎘染毒大鼠脾臟SOD和MDA的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠脾臟組織SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠脾臟組織SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表5。

2.6黃芪多糖對鎘染毒大鼠血清AST、ALT和LDH的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表6。

表3 各組NK細胞殺傷活性比較

與空白對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

表4 各組脾臟IL-2和TGF-β1含量比較

與空白對照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01，表6同

表5 各組脾臟SOD活性和MDA含量比較

與空白對照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

表6 各組AST活性、ALT活性和LDH 活性比較

3 討 論

鎘是一種銀白色有光澤的重金屬，有延展性和韌性，廣泛存在于自然界中。鎘可通過水、食物、密切接觸等多種途徑進入機體，其工業(yè)生產(chǎn)所造成的環(huán)境污染通過食物鏈進入體內(nèi)為主要途徑。鎘對腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，被美國毒物管理委員會列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)。有研究顯示〔9〕，鎘不但能與SOD 中的二價金屬離子發(fā)生競爭性替代作用，抑制 SOD的活力，也能夠促進體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而不斷消耗SOD。同時，鎘也可與體內(nèi)含有巰基的抗氧化物及抗氧化酶結合，從而導致脂質(zhì)過氧化作用增強〔10〕。黃芪作為甘肅的道地藥材，其根入藥，味甘、性溫，有補氣益氣、補氣升陽、固表止汗、托毒排膿等功效。黃芪的活性成分黃芪多糖具有增強和調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等作用〔11～15〕。

胸腺與脾臟是機體重要的免疫器官，其結構正常與否直接影響機體的免疫功能，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的高低變化可以反映機體的免疫功能狀態(tài)〔16〕。而淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細胞殺傷實驗則是另外一種反映機體的細胞免疫功能和非特異性免疫功能的常用指標〔17〕。此外，IL-2和TGF-β1在免疫功能的調(diào)節(jié)上屬于一對截然相反的指標。IL-2是機體正向免疫調(diào)節(jié)中最重要的細胞因子之一，主要由T淋巴細胞分泌，其功能是促進T、B淋巴細胞的增殖〔18〕。 TGF-β1 可能是免疫系統(tǒng)關閉的信號之一，其可以抑制所有淋巴細胞的增殖與功能〔19〕。

本研究結果提示黃芪可能是通過抑制鎘致大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應，增強其機體的抗氧化能力，進而降低機體的氧化應激水平來減輕鎘對機體造成的損傷。同時，本實驗結果也表明，鎘染毒之后，機體的免疫功能受損，黃芪總苷可能是通過調(diào)節(jié)機體免疫增強因子IL-2和免疫抑制因子TGF-β1的含量，從而糾正和改善機體的細胞免疫功能和非特異性免疫功能。因此，鎘中毒可以引發(fā)機體氧化和抗氧化之間的動態(tài)失衡，也可以引發(fā)機體發(fā)生免疫功能紊亂。而黃芪的機制可能通過提高機體的抗氧化能力，增強機體的免疫力，最終達到拮抗鎘毒性的目的，但其具體機制尚需進一步研究。