酸性離子通道3在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠疼痛中的作用

季慶輝 喬建民 薛宇 劉士臣 喬曉峰 顏玉 李恒威

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

酸性離子通道(ASIC)3在骨性關(guān)節(jié)炎動物模型中發(fā)揮的作用和膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射APETx2是否有一定的止痛作用尚未可知。本文假設(shè)APETx2通過抑制 ASIC3直接作用在周圍神經(jīng)系統(tǒng)緩解疼痛。本研究分析ASIC3在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生疼痛中的作用，探討APETx2是否通過抑制 ASIC3緩解疼痛。

1 材料與方法

1.1動物 36只雄性大鼠8周齡，重約270 g。本研究經(jīng)佳木斯大學(xué)動物倫理委員會同意。

1.2動物行為實驗 動物行為實驗在溫度21～23℃和濕度40%～60%控制的房間內(nèi)進行。

1.3骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備及分組 0.3 mol/L半胱氨酸液和4%木瓜蛋白酶液混合靜止30 min，1、3、7 d分別在左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.2 ml上述混合液行骨性關(guān)節(jié)炎造模。大鼠分為模型組、治療組和對照組。對照組不造模，治療組第3天、第1、2、3、4周，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入50 μl APETx2。模型組只造模不應(yīng)用其他藥物。

1.4馮·弗雷長絲測試 應(yīng)用von Frey刺激大鼠后爪，測定大鼠靜態(tài)下后爪反射，將大鼠放鋼絲網(wǎng)上30 min，并用有隔板的丙烯酸盒將每個大鼠分開，每個空間大小為8 cm×5 cm×10 cm。將von Frey垂直于足底后爪,直到von Frey表面彎曲，保持3 s或爪子撤回，說明對疼痛敏感。von Frey刺激強度10.0 g。機械敏感性測試：注射后1、3、7、14、21、28 d，對von Frey有反射表示有繼發(fā)性疼痛。

1.5逆行標記膝關(guān)節(jié)傳入纖維 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，然后膝關(guān)節(jié)剃毛，在左側(cè)膝關(guān)節(jié)切5～6 mm長皮膚切口，將10 μl生理鹽水稀釋的固藍B鹽(FB)0.1 mg注入膝關(guān)節(jié)腔逆行標記。傷口用5-0絲綢固定。

1.6免疫組織化學(xué) FB注射后7 d，所有大鼠被過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死,摘除左側(cè)L3～L5背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，檢查FB分布情況。DRG被放置在4%多聚甲醛和30%蔗糖中過夜固定,石蠟包埋,-80℃保存。用低恒溫切片機切10 μm切片放在載玻片上，暴露常溫下干燥，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，5 min。10%羊血清37℃封閉60 min,兔血清抗-ASIC3孵育12 h后用PBS液沖洗5 min，3次,暗室中加山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G-異硫氰酸熒光黃(FITC)(1∶500)孵化2 h搖床振蕩15 min 3次,封片。在Olympus BX-51(Olympus,Tokyo,Japan)顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計DRG中ASIC3陽性細胞平均百分比。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件行多因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1馮·弗雷長絲測試實驗 各組大鼠后爪對von Frey 10.0 g力發(fā)生的反應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第3～28天，模型組和治療組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雖然第1天治療組在APETx2注射后反射有所減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；對照組組和治療組后爪反射相似。見圖1。FB逆行標記膝關(guān)節(jié)傳入纖維在DRG分布情況及ASIC3在各組DRG中免疫熒光的標記結(jié)果見圖2。

與對照組比較：1)P<0.01；與治療組比較：2)P<0.05圖1 馮·弗雷長絲測試實驗

圖2 FB在DRG中逆向標記及ASIC3在DRG中的 免疫熒光標記結(jié)果(比例尺:100 μm)

2.2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 ASIC3陽性表達在L3～L5同側(cè)DRG細胞中。對照組與模型組，ASIC3陽性細胞百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔(28.17±2.41)% vs (45.59±2.83)%,P<0.05〕,治療組ASIC3陽性細胞百分比為(19.15±1.61)%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

木瓜蛋白酶能分解關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白多糖，加速蛋白多糖從關(guān)節(jié)軟骨中丟失，改變關(guān)節(jié)軟骨生物學(xué)特性，促進關(guān)節(jié)軟骨退變進程。由于在大鼠關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶容易復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎模型，通過4%木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)腔注射方法，獲得大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。

前人研究顯示，在后爪注射弗氏佐劑可引起急性炎癥大鼠模型DRG細胞核中ASIC3 mRNA及蛋白質(zhì)含量增加〔1〕。免疫測試數(shù)據(jù)與von Frey實驗測試數(shù)據(jù)符合。APETx2注射膝關(guān)節(jié)腔，沒改變骨性關(guān)節(jié)炎模型的原發(fā)性疼痛。ASIC3-/-大鼠后爪注射酸以及炎癥反應(yīng)不能引起機械性疼痛〔2〕。

APETx2通過干擾siRNA下調(diào)ASIC3水平可能發(fā)生在局部脊髓，不能明確APETx2在周圍神經(jīng)還是在中樞神經(jīng)起作用。本研究表明ASIC3在骨性關(guān)節(jié)炎大鼠周圍神經(jīng)對疼痛控制中起到一定作用。繼發(fā)性疼痛取決于激活A(yù)SIC3在初級傳入纖維。研究顯示在模型組和治療組原發(fā)性疼痛沒有區(qū)別，炎性疼痛、機械和熱的疼痛,在ASIC3-/-和ASIC3+/+大鼠沒有區(qū)別〔3〕。原發(fā)病灶周圍ASIC3被激活后，疼痛信息通過周圍神經(jīng)傳導(dǎo)到PRG，從而產(chǎn)生繼發(fā)性疼痛，而對原發(fā)病灶疼痛不能發(fā)揮作用，表明ASIC3不會導(dǎo)致直接傷害感受器激活。本研究表明ASIC3能作為老年骨性關(guān)節(jié)炎引起繼發(fā)性疼痛的靶點。