遠志皂苷元對內皮祖細胞移植治療急性心肌梗死模型大鼠心功能的影響

靳文學 喬秀蘭

(重慶市中醫院 1心血管科，重慶 400021；2針灸科)

急性心肌梗死(AMI)是全球發病率較高的一種疾病，外科手術和介入治療是AMI目前主要臨床傳統療法，此兩種療法均旨在重新建立血供，但對損傷的心肌組織和細胞并無修復效果。內皮祖細胞(EPCs)是與血管新生有關的骨髓干細胞亞群〔1〕，國內外諸多研究已經表明，EPCs在重建血供〔2〕、促進缺血性組織血管新生〔3〕，向心肌細胞和內皮細胞等細胞的分化〔4,5〕、緩解內皮功能障礙的肺動脈高壓〔6〕及腫瘤防治等方面有卓越表現。在AMI治療方面，EPCs移植也表現出了令人滿意的療效，EPCs移植可促進血管重建，改善心臟功能；向毛細血管內皮細胞分化，促進心肌梗死的恢復，改善心臟功能〔7～9〕。遠志是我國傳統的藥材，其主要的活性組分有皂苷類、黃酮類、寡糖酯和生物堿等。遠志皂苷元是其藥理作用的主要活性成分之一，其在抗氧化、抑制炎癥、抗衰老及抗細胞毒性方面療效卓著〔10〕。在AMI進程中，心肌缺血再灌注會加劇內質網應激，引發心肌細胞凋亡，加重心肌梗死危害〔11〕，李子希等〔12〕研究表明，遠志皂苷元可通過緩解內質網應激保護心肌。此外，遠志皂苷元可促進血管內皮細胞增殖和活化，抑制內皮細胞的凋亡〔13～16〕。據此推測，遠志皂苷元可提高EPCs移植的作用效果，然而目前遠志皂苷元對EPCs移植治療心肌梗死大鼠影響的研究尚為空白。本文旨在探討遠志皂苷元干預和EPCs移植聯合治療對AMI大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只體重300～350 g健康SD大鼠(2.5月齡左右，雄性)由重慶醫科大學提供，室溫25℃，濕度50%～80%，SPF環境下自由飲水和采食，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。

1.2主要材料 實驗所用顯微鏡均由上海儀圓光學提供，二氨基聯苯胺(DAB)購自北京化學試劑集團有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)由Hyclone提供；細胞培養箱購自Heraeus Sepatech 公司。外周血內皮祖細胞由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院提供。EBM-2培養基、胎牛血清均購自Hyclone；Trizol試劑盒購自Invitrogen；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度試劑盒(增強型)、5×十二烷基磺酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、20×三乙醇胺緩沖鹽水(TBS)緩沖液等購自南京建成生物。SP-DiI染料購自北京大清生物技術有限公司；血管內皮生長因子(VEGF)抗體購于北京百邁客生物科技有限公司，β-actin抗體購于艾康生物技術(杭州)有限公司。生理鹽水從上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院購進。超凈工作臺提供自藝斯高上海貿易有限公司。熒光染色溶液的配制：將2.5 g SP-Dil染料用1 L的二甲基酰胺(DMF)溶解。遠志皂苷元購自上海誠凜生物科技有限公司。

1.3建立大鼠模型及實驗分組 取80只SD雄性大鼠建立AMI模型：麻醉大鼠，氣管插管進行機械通氣并密切監測心電變化。對所有實驗大鼠開胸，辨認并結扎左冠狀動脈前降支近段，以結扎冠狀動脈后心肌顏色變暗、心臟變大、左室前壁局部心肌運動明顯減弱及心電圖ST段抬高為標準判定AMI模型建立成功與否。判定后縫合大鼠胸部切口后將之放回籠中飼養，將實驗大鼠平均隨機分為四組：AMI對照組(組Ⅰ)、遠志皂苷元治療組(組Ⅱ)、EPCs移植組(組Ⅲ)、EPCs移植聯合遠志皂苷元治療組(組Ⅳ)，各20只。

1.4體外復蘇并培養擴增大鼠外周血EPCs 將凍存原代EPCs置于60℃恒溫水浴箱，30 s內進行EPCs快速復蘇。融化之后迅疾轉入EP管并加入EBM-2培養基，重復小心吹打細胞使其均勻分布，隨后離心棄上清液。將復蘇后的細胞用EBM-2完全培養基調整為1×106/ml的密度。進行培養待EPCs匯合度達80%以上時，胰蛋白酶溶液消化2～3 min后終止消化；離心棄上清重懸細胞。調整細胞密度至1×106/ml培養7 d。離心棄上清，將EPC細胞密度調整為8×105/ml，加入5 μl CM-Dil標記細胞；隨后置于培養箱中標記孵化25～30 min后離心棄上清PBS重懸，重復標記兩次，顯微鏡下觀察細胞標記的情況。鏡下可見EPCs標記顯現出鮮艷的橘紅色，且顏色均勻，備用。實驗大鼠建模1 h之后，進行EPCs移植和遠志皂苷元干預治療。將100 μl CM-Dil標記好的EPCs細胞懸液分5點分別注射到組Ⅲ及組Ⅳ心肌梗死區域的邊緣，尾靜脈注射100 μl生理鹽水；將100 μl生理鹽水分5點分別注射組Ⅱ大鼠心肌梗死區邊緣，組Ⅱ和組Ⅳ尾靜脈注射3 mg/ml遠志皂苷元溶劑；分別于組Ⅰ心肌梗死區域邊緣和尾靜脈注射與上述EPCs混懸液和遠志皂苷元試劑相同體積的生理鹽水；連續治療3 d。

1.5超聲心動圖檢測大鼠心功能改變及毛細血管密度 EPCs移植后3 w及6 w，分別從各個實驗組選取5只大鼠進行心功能變化測定。采用超聲診斷儀記錄3個心動周期左室收縮末期內徑(LVDs)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)并計算左室射血分數(LVEF)的平均值。于移植后3 w和6 w，處死大鼠迅速打開其胸腔，剝離出大鼠心肌梗死組織將之分為3份：1份置于液氮中備用；1份石蠟組織制片備用免疫組化染色；1份冰凍組織切片備用蘇木精-伊紅染(HE)染色。對心肌梗死組織進行石蠟包埋組織切片，CD34免疫組化染色并于顯微鏡下計數平均毛細血管密度。

1.6逆轉錄聚合酶鏈反應及酶聯免疫吸附測定梗死周邊區VEGF基因及蛋白的表達 研磨勻漿大鼠心肌梗死組織并提取組織的總RNA，通過Primer Primer5.0軟件設計引物，VEGF引物序列上游：5′-AGAAGGAGGAGGGCAGAATCA-3′；下游：5′-CAAATGCTTTCTCCGCTCTGA-3′，目的片段長度326 bp；參照物β-actin引物序列上游：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′；下游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGCGTGAC-3′，片段長度為471 bp。反應后瓊脂糖凝膠電泳并成像儀攝片，用Image proplus6.0圖像分析軟件測算電泳條帶的OD值，進而計算其相對表達量。取大鼠心肌梗死區域組織勻漿液，4 000 r/min離心取組織上清液，用ELISA試劑盒(購自南京建成生物有限公司)測定VEGF含量。根據免疫顯色反應的當量關系可知實驗大鼠心肌梗死組織的VEGF水平。

1.7熒光顯微鏡觀察心肌內移植內皮祖細胞EPCs 干預治療3 w和6 w之后制作大鼠心肌梗死組織冰凍切片并進行4′，6-二脒基-2苯基吲哚染色。干燥后，顯微鏡下觀察時，隨機選取每張冷凍切片的3個視野并且對之進行拍照記錄；假設每張照片的總亮度為1，每張照片選取一個光亮度點，利用ACDsee5.0軟件確定其坐標值。隨機選取5個視野，計數CM-Dil陽性細胞數及細胞總數，計算標記率。標記率=視野內陽性細胞總數/視野內細胞總數×100%。

1.8大鼠心肌修復情況 取出大鼠心肌梗死組織，10%甲醛固定組織；梯度酒精脫水，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，隨后進行浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成5～8 μm薄片。將薄片燙平，再貼到載玻片上，45℃恒溫烘干。脫蠟后，進行HE染色。染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明。將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠干燥后，熒光顯微鏡下觀察各組心肌梗死組織的病理學變化。于治療后3 w和6 w，選取各個實驗組5只大鼠麻醉處死，立即取出大鼠的心臟于液氮凍存30 min。隨后取長軸垂直方向1～2 mm切片，以2，3，5-三蘇基氨化四氮唑(TTC)染色法計算心肌梗死面積〔17〕。

1.9統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1EPCs形態觀察 冷凍保存的EPCs復蘇后重懸于新鮮的EPCs細胞培養液中，多數細胞生長良好。培養5～6 d發現細胞明顯增殖即可傳代，移植后2 w細胞呈平形排列或漩渦狀集落生長，排列緊密；傳代后的細胞傳至第3代細胞生長迅速，純度高、 形態單一(圖1)。選取第3代細胞進入實驗。

2.2大鼠心功能改變檢測結果 在細胞移植和藥物干預3 w及6 w后，與組Ⅰ相比，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心功能和左室收縮舒張功能明顯改善(P<0.05)；組Ⅳ較組Ⅱ、Ⅲ顯著提高了大鼠的心臟功能和左心室的舒縮能力(P<0.05)。見表1。

圖1 第3代 EPCs的形態(×200)

組別移植后3 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)組Ⅰ0.14±0.020.53±0.110.63±0.120.32±0.210.56±0.2646.42±9.4323.21±6.17組Ⅱ0.11±0.021)0.48±0.101)0.66±0.081)0.25±0.201)0.70±0.251)65.72±8.241)32.71±6.421)組Ⅲ0.10±0.031)0.47±0.111)0.69±0.101)0.24±0.181)0.71±0.241)65.80±7.921)32.78±6.751)組Ⅳ0.08±0.021)2)3)0.37±0.081)2)3)0.72±0.111)2)3)0.16±0.091)2)3)0.87±0.221)2)3)75.89±4.661)2)3)42.75±7.351)2)3)組別移植后6 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)組Ⅰ0.15±0.030.57±0.090.65±0.140.31±0.160.58±0.2249.54±8.5625.12±6.23組Ⅱ0.13±0.031)0.52±0.081)0.68±0.121)0.25±0.171)0.72±0.231)69.45±9.052)35.65±7.061)組Ⅲ0.12±0.041)0.51±0.091)0.69±0.131)0.24±0.151)0.73±0.221)69.89±9.341)35.86±7.341)組Ⅳ0.10±0.031)2)3)0.41±0.061)2)3)0.74±0.121)2)3)0.17±0.161)2)3)0.85±0.221)2)3)77.25±8.441)2)3)47.34±7.661)2)3)

與組Ⅰ比較：1)P<0.05;與組Ⅱ比較：2)P<0.05;與組Ⅲ比較：3)P<0.05，下表同

2.3毛細血管密度的測定 與組Ⅰ相比，治療3 w后組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均顯著增加了心肌梗死組織中的新生毛細血管密度，組Ⅳ較組Ⅲ明顯增高(P<0.05)。治療6 w后，各組新生毛細血管密度均較治療3 w后顯著增加，而組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均顯著高于組Ⅰ(P<0.05)，組Ⅳ效果最佳。見表2。

2.4VEGF基因和蛋白的表達 與組Ⅰ相比，治療3 w后組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心肌梗死組織中VEGF mRNA和蛋白相對表達水平均顯著提高(P<0.05)，組Ⅳ顯著高于其他組(P<0.05)。在治療6 w后，各組心肌梗死組織中VEGF mRNA和蛋白相對表達水平較治療3 w明顯提高；組Ⅱ、Ⅲ VEGF mRNA和蛋白表達水平顯著高于組Ⅰ(P<0.05)，而組Ⅳ明顯高于組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)。見表2和圖2。

表2 各組新生毛細血管密度、心肌梗死組織VEGF mRNA和蛋白表達水平及心肌梗死面積

圖2 各組VEGF mRNA和蛋白表達

2.5CM-Dil標記陽性EPCs 治療3和6 w后，組Ⅱ和組Ⅰ未見CM-Dil標記陽性EPCs；組Ⅳ與組Ⅲ可觀察到較多的CM-Dil標記陽性EPCs，組ⅣCM-Dil陽性EPCs明顯多于組Ⅲ。見圖3。

2.6心肌修復情況 在干預治療3 w之后，組Ⅰ心肌組織發生了明顯的組織病理學變化，如心肌梗死區域內肌纖維溶解、心肌肌組織發生斷裂，心肌細胞排列紊亂；治療各組心肌梗死組織形態學病變明顯緩解，心肌組織區域正常，心肌細胞排列較為整齊，有明顯的新生毛細血管存在；其中組Ⅳ心肌梗死狀況明顯好轉，新生毛細血管最多，心肌細胞排列整齊度最佳(圖4)。治療3 w和6 w后，與組Ⅰ相比，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的心肌梗死區域梗死面積顯著降低,組Ⅳ低于其他各組。見表2。

圖4 各組心肌修復情況(×200)

3 討 論

在心肌缺血早期，往往出現心肌肥大和心肌膠原瘢痕，隨之即發生心功能障礙，心肌舒縮能力下降和心肌壞死。EPCs是主要存在于機體骨髓中的干細胞亞群。在機體發生某種病理狀況時，骨髓中的EPCs被動員進入外周血循環系統，開始向病理組織遷移。與其他干細胞特性相似，EPCs具有向組織缺血或者內皮損傷部位歸巢的特性，并最終黏附、結合在受損血管部位。在EPCs遷移歸巢過程中，VEGF等細胞因子發揮著重要作用。Miglionico等〔18〕通過對冠心病患者設置EPCs捕捉支架，取得了令人滿意的治療效果；這證明EPCs在心肌缺血性梗死部位的集聚對心肌梗死恢復具有重要作用。

國內外諸多研究已經表明，體外移植EPCs可顯著提高心肌梗死動物的心臟功能，促進新生血管的形成〔19，20〕。其主要機制可能是：(1)EPCs分化為血管內皮細胞并直接形成新的血管，重新構建血液供應；(2)旁分泌VEGF等，保護心肌梗死部位的損傷細胞；(3)EPCs還可與宿主的細胞相互融合，增強缺血區域的心肌細胞功能。然而，Yao等〔21〕研究顯示，體外移植的EPCs在宿主體內存活時間有限，因此這限制了EPCs移植效果。Schuh等〔22〕和Sen等〔23〕通過適當輔助性支持EPCs的移植，提高了EPCs的心肌梗死治療效果，改善了心肌梗死后的心臟功能。遠志皂苷元可促進血管內皮細胞的增殖并抑制內皮細胞的凋亡，據此推測其對于EPCs移植可能具有較好的輔助性支持效果。本研究結果顯示，EPCs體外移植后，遠志皂苷元明顯提高了EPCs移植效率，增加了EPCs在心肌梗死組織的含量。這提示遠志皂苷元還可通過提高EPCs在心肌梗死部位的存活率提高心肌梗死的治療效果。VEGF在正常人心肌中含量較低，但在冠狀動脈疾病中則表達水平急劇升高；只是VEGF的受體表達水平也隨之提高，進而提高了內皮細胞增殖，放大了VEGF生物學效應〔24〕。VEGF可以促進血管內皮細胞的增殖，促進心肌血管的形成，增加血供〔24～26〕。此系因體外移植的EPCs及其分化而成的內皮細胞分泌增加所致。

綜上，遠志皂苷元干預提高了EPCs的移植效率，增加了EPCs在心肌梗死組織中的存留，進而促進心肌梗死恢復。遠志皂苷元干預和EPCs移植的聯合治療提高了EPCs移植效率和治療效果，其主要通過促進心臟功能恢復、緩解心肌組織病變、提高新生血管密度和VEGF的表達水平。遠志皂苷元的干預對EPCs移植起到了明顯的輔助支持作用，并為該細胞移植治療心肌梗死開辟新的途徑和思路，但其機制尚需要進一步探討。