自噬基因AMBRA1 在宮頸癌中的表達及其臨床意義

彭成清 張 雪 張 力 陳洪雷

(武漢大學基礎醫學院病理學教研室 武漢 430071)

宮頸癌是子宮頸上皮細胞發生異常惡性增殖產生的腫瘤，是發展中國家女性第二大常見腫瘤[1]。來自2018年全球宮頸癌統計新發病例中，90%來自發展中國家如非洲和亞洲，同年因宮頸癌死亡的病例中95%也來自發展中國家[1]。宮頸癌的發生發展是經由多個階段演變、多種癌基因共同參與的復雜病理過程，但具體機制仍不是十分清楚。近年來研究表明惡性腫瘤的發生、發展與細胞自噬活性的變化有關。細胞自噬是真核細胞特有的生命現象，是細胞物質代謝的重要途徑，參與人體的多種生理及病理過程，比如參與維持細胞內蛋白代謝平衡及內環境穩定的維持，在結構重建、廢物清除以及細胞生長發育中起重要作用，而自噬功能異常與腫瘤形成有關。近些年來，關于自噬與腫瘤關系的研究不斷深入，通過調節自噬活性影響腫瘤細胞的增殖從而對腫瘤起到治療作用。AMBRA1(Autophagy/Beclin 1 regulator 1)是一個重要的自噬相關基因，參與了自噬體的形成，在多種惡性腫瘤細胞中表達，通過調節自噬活性，在腫瘤的發生、發展中起到作用[2]。而AMBRA1在子宮頸癌中的表達變化及作用尚無明確報道。本研究利用量子點(quantum dots，QDs)免疫熒光技術檢測宮頸癌及子宮頸非癌變組織中自噬相關基因AMBRA1的表達情況，探討其對宮頸癌的影響，期待能夠為宮頸癌的治療提供一個新的切入點。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌組織芯片資料統計

CXC1021購自桂林泛譜生物技術有限公司，14×8點陣，每點直徑1.5mm，4μm厚，每例組織均有1點。其中包括97例宮頸癌(鱗癌、腺癌和腺鱗癌)，其中高、中分化59例，低分化38例；無淋巴結轉移者72例，有淋巴結轉移者25例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期有73例，Ⅲ、Ⅳ期者24例；15例正常和炎性宮頸組織。所有組織均來自臨床婦科切除標本，經10%中性緩沖甲醛固定24h。術前均未接受過放療或化療，術后依據病理結果適當增加不同程度的輔助治療，年齡24～68歲，平均年齡44歲，≥44歲的51例，<44歲的46例。宮頸癌病理分期按WHO分級標準，臨床分期按FIGO的標準。

1.2 試劑

兔抗人AMBRA1多克隆抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司(英國abcam公司上海辦事處)；量子點標記的鏈霉親和素復合物(QDs-SA)檢測試劑盒購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司。

1.3 量子點免疫熒光組織化學技術檢測蛋白的表達

詳細方法和步驟參見以往發表的文獻[3]，用量子點超敏熒光試劑盒(605nm QDs-SA)檢測相關蛋白表達，4μm厚連續切片的組織芯片經過脫蠟、水化、微波修復抗原、TBS洗滌，封閉緩沖液37℃濕盒孵育30min，滴加AMBRA1(工作濃度為1∶25)抗體、37℃孵育2h，TBS-T漂洗3min/次×3次；然后滴加生物素化羊抗兔IgG(工作濃度為1∶400)，37℃濕盒孵育0min，TBS-T漂洗3min/次×3次；最后滴加QDs-SA (1∶100)37℃濕盒孵育30～60min前，仍然需要封閉緩沖液37℃濕盒孵育10min，類似的漂洗，滴加90% 甘油封片，上熒光顯微鏡Olympus BX53(CCD DP74)藍光激發，以細胞內出現紅色的熒光信號為陽性，綠色為背景自發熒光。用TBS代替一抗作空白對照，以已知陽性片作陽性對照，觀察顯示AMBRA1蛋白定位于細胞質囊和(或)自噬體。結合我們已經發表的文獻[4]，采用雙盲法并由經驗豐富的病理專家對本研究結果進行半定量評分，陽性面積(0～3分)和陽性強度(0～2分)的乘積≥2被判斷為陽性表達。

1.4 統計學分析

采用 SPSS22.0 軟件進行統計學分析，計數資料用χ2檢驗和四格表精確概率法。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

組織芯片經IHC 染色后發現2例腫瘤組織芯點發生脫片，剔除此2例腫瘤病例的組織學，觀察剩余95例腫瘤組織。

AMBRA1可在正常或炎癥宮頸組織中表達，在癌細胞中主要表達在細胞質，但基質幾乎是陰性。結果如表 1所示，95例宮頸癌組織中AMBRA1的陽性率為54.7%，與非癌變宮頸組織的陽性率86.7%(13/15)比較，差異有統計學意義(P=0.019)。AMBRA1在鱗癌中表達更高，與非鱗癌其他腫瘤相比，差異有顯著性(P=0.026)；并且在低的TNM分期中表達率為61.4%，顯著高于高TNM分期患者的表達率36%(P=0.043)，而與AMBRA1不同年齡組、病理分級和淋巴結轉移差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 AMBRA1 蛋白與宮頸癌臨床病理參數的關系

臨床參數例數AMBRA1陰性(%)陽性(%)P值年齡(歲)<444520(44.4)25(55.6)≥445023(46.0)27(54.0)0.879病理分級高、中分化5722(38.6)35(61.4)低分化3821(55.3)17(44.7)0.110組織類型鱗癌7429(39.2)45(60.8)非鱗癌2114(66.7)7(33.3)0.026TNM分期Ⅰ+Ⅱ7027(38.6)43(61.4)Ⅲ+Ⅳ2516(64.0)9(36.0)0.028淋巴結轉移N07128(39.4)43(60.6)N1^32415(62.5)9(37.5)0.050

3 討論

自噬是一種自我降解機制，并與腫瘤的進展密切相關[5]。從20世紀末以來，人們陸續在許多實驗中發現多種腫瘤細胞的自噬能力都要低于相同部位的正常細胞，而且不同種類的腫瘤細胞雖然在癌變前自噬能力有所不同，但是在癌變后它們大多數的自噬能力均會減弱。盡管自噬在腫瘤中的作用還不清楚，但越來越多的研究表明，自噬在腫瘤的調節中可能具有促進與抑制的雙重作用：一方面，自噬能使腫瘤細胞忍受一些應激反應，如缺氧微環境、饑餓和某種形式的治療，而得以生存；另一方面，自噬在應激反應引起的損傷緩解中起著重要的作用，從而抑制腫瘤的發生[6]。卵巢癌、子宮內膜癌及宮頸癌等常見婦科惡性腫瘤組織中都存在自噬活性降低的現象[7]。Valentina[8]等研究自噬與細胞增殖調控，細致地描述了前自噬蛋白AMBRA1在調節細胞增殖方面和作為抑癌基因的作用特征。AMBRA1作為自噬上游調節因子之一， 形成支架蛋白多途徑調節自噬，它是 Beclin1 依賴的細胞自噬中一個正性調節蛋白，它與 Beclin1 和 PI3KC3 形成復合物，參與自噬的調控。Fimia 等[9]研究表明，AMBRA1可以特異地結合微管動力蛋白馬達復合體上的 DLC1；當自噬發生時，AMBRA1 即從 DLC1 上解離下來，然后定位到內質網與 Beclin1 結合，使吞噬泡聚集。最近研究發現，AMBRA1通過調節自噬從而影響乳腺癌細胞對表柔比星的化療敏感性[10]。

從以上可知，AMBRA1可參與腫瘤細胞的自噬并影響腫瘤的治療，而在宮頸癌中的作用如何呢？本研究對 95 例宮頸癌和15例非癌性宮頸病例進行了各項病理因素的相關性分析和比較，結果顯示宮頸癌中 AMBRA1 陽性表達率顯著低于非癌性宮頸組織，表明自噬可能參與了宮頸癌的發生。而在鱗癌中AMBRA1表達顯著高于非鱗癌亞型，可能與鱗癌的發生機制特別是高危HPV的感染調節有關[11]。本研究還發現AMBRA1 高表達與TNM的低分期顯著相關，提示在晚期宮頸癌患者(高TNM分期)自噬不足可促進腫瘤的惡性進展。AMBRA1與其他臨床病理參數如年齡、病理分級以及是否淋巴結轉移無顯著相關。

總之，自噬基因AMBRA1 蛋白表達缺失可能促進宮頸癌的形成和惡性進展，其分子機制可能與HPV感染、腫瘤能量代謝的調節等有關，這將有待進一步擴大病例數并結合體外實驗繼續研究。