CIK與NK細胞聯合應用對腫瘤細胞的殺傷性研究

張光輝，邵小燕，嚴小敏

（重慶國聯干細胞技術有限公司，重慶 401325）

近年來，隨著腫瘤免疫學的發展，對于腫瘤的治療，細胞免疫治療已經成為繼手術、放療、化療的第四種模式。常用的免疫細胞主要有細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells, CIK）、自然殺傷細胞（natural killer cells, NK）、樹突狀細胞（dendritic cells, DC）等[1]。CIK細胞是主要表達CD3+CD56+的一群淋巴細胞，而NK細胞主要表達CD3-CD56+。CIK、NK等細胞治療是通過提取患者外周血的單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在體外誘導擴增而制備所得[2]。大量的臨床研究表明，CIK、NK具有提高腫瘤臨床治愈率、減少腫瘤復發、改善生活質量、延長生存期等作用[3]。目前，體外誘導CIK和NK的技術都比較成熟，可以獲得滿足臨床使用的細胞。但是，臨床中所使用的細胞多為CIK或NK單獨使用，聯合應用進行治療的較少，且聯合應用對腫瘤細胞的殺傷功能缺乏報道。本研究通過采集腫瘤患者的外周血體外誘導擴增得到CIK和NK，對兩種細胞聯合應用對腫瘤細胞的殺傷功能進行檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至7月在重慶新橋醫院所收治的10例腫瘤患者（均簽署知情同意書），年齡43～68歲，平均年齡為（53.6±3.2）歲，其中男性6例、女性4例。其中肺癌3例，乳腺癌2例，胃癌2例，宮頸癌1例，肝癌1例，食管癌1例。所有患者在采集外周血15天內未接受放化療。

1.2 實驗材料

重組人白介素2（interleukin-2，IL-2，100萬IU/瓶），購自北京四環生物制藥有限公司；重組人白介素12（50 μg/支）、重組人白介素15（50 μg/支）、抗人CD3單抗（500 μg/支）、重組人γ-干擾素（100 μg/支），均購自北京同立海源生物科技有限公司；培養基（GT-T551，1 L/瓶），購自寶日醫生物技術有限公司；淋巴細胞分離液（LTS1077，200 mL/瓶），購自天津灝洋生物制品科技有限公司；CD3-FITC（100tests/支）和CD56-APC（100tests/支），購自Biolegend公司；CCK-8，購自碧云天生物技術研究所；人慢性髓系白血病細胞K562細胞，購自中科院上海細胞生物研究所；T75、T225細胞培養瓶、移液管、離心管等無菌耗材，購自康寧公司；培養箱為賽默飛3111；離心機為艾本德5810/5810R；細胞計數儀為Nexcelom AUTOT4；流式細胞儀為BD Accuri C6；分析軟件為BD Accuri CFLOW。

1.3 CIK、NK的細胞制備[4]

清晨飽腹后抽取患者外周靜脈血50 mL于肝素鈉采血管中，離心獲取血清及全血細胞。收集血清經56 ℃水浴滅活30 min后，離心獲取上清即自體血漿備用。全血細胞經生理鹽水1∶1稀釋后使用淋巴細胞分離液離心獲取PMBC。PMBC重懸于含有10%自體血漿的培養基中，調整細胞密度為1.5×106個/mL。CIK細胞培養：添加抗人CD3單抗、γ-干擾素、IL-2。NK細胞培養：添加IL-2、白細胞介素-12、白細胞介素-15。細胞懸液移入培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。培養期間抽樣計數，根據細胞生長計數情況進行補液擴瓶，控制細胞密度為1.0×106個/mL。

1.4 細胞純度檢測

分別取第14天的細胞懸液，離心重懸，調整細胞濃度為1.0×107個/mL，每管100 μL。CIK、NK細胞表型檢測：分別加入抗體CD3-FITC、CD56-APC各2 μL，孵育20 min洗滌后行流式細胞表型檢測，CIK檢測CD3+CD56+細胞的比例，NK檢測CD3-CD56+細胞的比例。

1.5 細胞殺傷活性檢測

使用CCK-8檢測試劑盒進行細胞殺傷活性的檢測。取培養第14天的細胞懸液，離心后調整細胞密度為1.0×106個/mL，作為效應細胞。取對數生長期的人慢性髓系白血病細胞K562細胞，調整細胞密度為5.0×104個/mL，作為靶細胞。按照效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1的比例進行細胞混合，培養于96孔板內，每孔總體積2 mL。同時，設置效應細胞孔、靶細胞孔、空白對照孔，實驗組為CIK組、NK組、CIK/NK聯合組（1∶1）每組設3個復孔。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養24 h后，加入CCK-8試劑20 μL，置入培養箱繼續孵育4 h后于450 nm測定吸光度（A）值。按如下公式計算細胞殺傷活性：殺傷率=[1-（實驗孔A值-效應細胞孔A值）∕靶細胞孔A值]×100%。

1.6 統計學處理

使用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料符合正態分布用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞的培養情況

培養的CIK、NK細胞第14天時，CIK細胞數量達到（5.3±1.2）×109（F=13.325，P=0.018，n=10），NK細胞數量達到（5.3±1.2）×109（F=15.428，P=0.016，n=10）。CIK細胞的純度為（50.7±1.2）%（F=15.354，P=0.017，n=10），NK細胞的純度為（46.3±4.7）%（F=16.337，P=0.018，n=10）。由細胞的數量和純度來看，培養所得的CIK、NK細胞可以滿足臨床使用。

2.2 細胞殺傷活性檢測

以培養第14天的細胞作為效應細胞，K562細胞為靶細胞，在效靶比5∶1、10∶1、20∶1下的殺傷情況為：CIK細胞組的殺傷率分別為（31.2±1.5）%、（42.7±2.1）%、（61.3±2.2）%，不同組間差異有統計學意義（F=16.724，P=0.016）。NK細胞組的殺傷率分別為（35.4±1.7）%、（46.2±2.3）%、（63.5±2.1）%，不同組間差異有統計學意義（F=13.521，P=0.015）。CIK/NK 1∶1聯合組的殺傷率分別為（48.1±1.9）%、（61.3±2.5）%、（81.2±2.6）%，不同組間差異有統計學意義（F=16.432，P=0.018）。由此可見，CIK/NK聯合應用對腫瘤細胞的殺傷率高于單獨使用CIK和NK細胞。

3 討 論

免疫細胞是人體發揮免疫功能的重要細胞，其通過血液、淋巴循環分布在免疫器官和組織中。CIK和NK細胞是進行腫瘤免疫治療的兩個重要部分。CIK是一群具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性及NK細胞的非主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）限制性細胞，CD3+CD56+細胞是其主要的效應細胞。CIK細胞主要是以MHC限制性的方式殺傷靶細胞，DC細胞通過MHC限制性的方式抗原呈遞給CIK細胞，以激活CIK細胞的殺傷效應，清除殘存的腫瘤細胞而發揮更加強大的細胞毒性作用[5]。NK細胞是一群表達CD3-CD56+的淋巴細胞，NK細胞對腫瘤和病毒的識別無MHC限制性，不依賴于抗體，無需致敏就可以發揮殺傷腫瘤和病毒的功能[6]。NK細胞也是機體抗腫瘤、抗感染的第一道防線。NK細胞還可分泌多種細胞因子，如穿孔素、細胞毒因子、TNF、IFN-γ、IL-2等來發揮免疫監視功能[7]。CIK細胞能夠特異性的殺傷腫瘤細胞，但無法識別不表達MHC-I類分子的腫瘤細胞，而NK細胞能識別不表達MHC-I類分子的腫瘤細胞，并能殺傷腫瘤細胞，因此，兩者的共同回輸可對大部分腫瘤細胞進行有效殺傷[8]。

本研究采集了10例腫瘤患者的外周血，通過體外誘導擴增，獲取CIK、NK細胞，并對其體外殺傷活性進行了檢測。結果表明，體外培養可以獲得滿足臨床治療所需數量和純度的細胞。對K562腫瘤細胞的殺傷效果來看，CIK、NK細胞聯合應用高于單獨使用，可以證實兩者的共同作用不僅僅是兩種細胞殺傷毒性的簡單疊加，而是因為二者可相互促進各自的活化與免疫反應，顯著提高機體的免疫反應。

本研究為CIK、NK細胞聯合應用于腫瘤免疫治療提供了體外實驗依據，因而提示我們可以在臨床上聯合應用CIK和NK細胞進行腫瘤治療，增強抗腫瘤活性，提高臨床緩解率，改善患者生活質量。