預熱處理對谷氨酰胺轉氨酶催化羊乳熱穩定性的影響

陳思，張富新*，王畢妮，邵玉宇，曹斌云

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)2(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌，712100)

羊乳富含蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質、維生素以及多種生物活性物質，營養組成更接近母乳，是一種易被人體消化吸收的天然營養食品。由于羊乳的蛋白質組成與牛乳有較大差別，在加工過程中存在一定難度，尤其是在超高溫瞬時滅菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)處理過程中，蛋白質穩定性差，易出現蛋白質沉淀現象[1]。為了提高羊乳的熱穩定性，通常采用添加穩定性鹽[2]、調節蛋白質組成[3]等方法進行處理，這些方法雖然對羊乳熱穩定性有明顯改善，但也會存在一定的安全隱患。隨著生物技術的發展，人們發現谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase, TGase)處理也可有效提高羊乳的熱穩定性。

TGase是一種能催化蛋白質間酰基轉移反應的酶，在蛋白質間形成共價鍵，促進蛋白質的交聯[4]，可改善蛋白質食品的保水性、黏彈性、穩定性等功能特性，已在肉制品、乳制品、水產品、大豆制品等富含蛋白食品中廣泛應用[5-6]。乳中蛋白是TGase的良好底物[7]，通過TGase交聯可有效改善乳制品的熱穩定性、凝膠化、持水性、黏度、乳化性等功能性質[8]。TGase交聯作用受乳成分的影響較大，乳中的蛋白質主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白由于其開放結構，易被TGase交聯，而乳清蛋白的球狀結構不易被交聯，但對乳清蛋白適當的變性處理，可顯著提高TGase的交聯作用[9]。同時乳中還存在天然TGase抑制劑[10-11]，能夠抑制TGase的活性，這種抑制劑對熱敏感，通過熱處理可有效清除。熱處理是目前乳制品加工的必經過程，不但可殺滅食品中有害微生物，保障食品安全，同時可使乳中乳清蛋白變性，滅活乳中的天然抑制劑。因此，本文通過研究羊乳的預熱處理促進TGase對羊乳蛋白的交聯，提高羊乳的熱穩定性，進而為液態羊乳產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳，西北農林科技大學試驗農場新鮮羊乳；谷氨酰胺轉氨酶(活性100 u/g)，江蘇一鳴生物科技有限公司；Nα-CBZ-Gln-Gly和L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸，美國Sigma公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，Solarbio公司。

1.2 儀器與設備

HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；Z206A臺式離心機，西安中團生物科技有限公司；BI-90Plus激光粒度分析儀，美國布魯克海文儀器公司；EYEL4真空冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；MULTISKAN GO全波長酶標儀，美國熱電公司；Power PacTM基礎電泳儀電源和Mini-Protean?Tetra Cell電泳槽，美國BIO-RAD公司；ChemiDoc-It?510化學發光成像儀，美國UVP公司。

1.3 羊乳熱穩定性的測定

羊乳熱穩定性的測定采用Fox[12]毛細管法，用熱凝固時間(heat coagulation time，HCT)表示。將羊乳在3 500×g下離心20 min去除脂肪。取60 μL的樣品密封于玻璃毛細管中，浸入140 ℃恒溫油浴中加熱，并不時旋轉玻璃毛細管，記錄從開始加熱到羊乳沉淀出現掛壁現象所需的時間，即為羊乳的熱凝固時間。

1.4 TGase活性的測定

TGase活性的測定采用Crossowicz比色法[13]。以Nα-CBZ-Gln-Gly為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸繪制標準曲線(y= 0.061 3x+ 0.046 8，R2= 0.999 2)。TGase酶活定義為37 ℃時每分鐘催化生產1 μmol的L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸所需的酶量。

將預熱處理的羊乳用3 mol/L HCl調pH至4.2[14]，在15 000×g下離心15 min，去除沉淀的酪蛋白，將上清液用10 kDa濾膜(Amicon)超濾后，除去乳清蛋白[15]，得到無乳蛋白的上清液，用于TGase活性的測定。

將試劑A(稱100 mg Nα-CBZ-Gln-Gly溶于2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中，加入2 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺、2 mL 0.01 mol/L還原型谷胱甘肽、4 mL 0.2 mol/L pH 6.0 Tris-HCl緩沖液)、試劑B(3 mol/L HCl、12% 三氯乙酸、5% FeCl3·6H2O按1∶1∶1體積比混合)在37 ℃下保溫15 min。取0.4 mL無乳蛋白上清液，配制成0.01 g/mL的TGase液，添加1 mL試劑A在37 ℃下反應10 min，然后加0.4 mL試劑B終止反應5 min，4 000×g離心5 min，取上清液，在525 nm處比色，測定吸光值。用TGase酶活標準曲線計算TGase活性及殘留酶活百分率。

(1)

式中：U，酶活，μmol/min；A，525 nm處的吸光度值；N，酶稀釋倍數；10，反應時間，min；V，參加反應的酶體積，mL。

(2)

式中：U0，預處理前的TGase酶活，μmol/min；Ui，預處理后的TGase酶活，μmol/min。

1.5 酪蛋白膠束粒徑的測定

將處理后的乳樣在3 500×g下離心去除上層脂肪，取10 mL脫脂乳，用去離子水進行1∶10稀釋，用BI-90Plus激光粒度分析儀在25 ℃下測定乳樣中的膠束粒徑。儀器參數設置為：分散介質：水；黏度：0.890 mPa·s；折光系數：1.330。

1.6 乳清蛋白變性率的測定

參照趙麗麗[16]的方法，將預熱處理的乳樣用1 mol/L HCl調整pH至4.2，在室溫下靜置10 min，然后在15 000×g下離心15 min去除酪蛋白，上清液為無酪蛋白液。在無酪蛋白液中加入15%的三氯乙酸(質量濃度)，使三氯乙酸最終濃度為12%，在3 500×g下離心使其乳清蛋白沉淀，上清液為非蛋白氮液。用自動凱氏定氮儀分別測定處理后的非酪蛋白氮(NCN)和非蛋白氮(NPN)的含量，然后計算乳清蛋白氮(WPN)和乳清蛋白變性率。

WPN=NCN-NPN

(3)

(4)

1.7 SDS-PAGE

參照LAEMMLI[17]的方法，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析羊乳蛋白質的交聯程度。將羊乳樣品用雙蒸水稀釋15倍，取1份上樣緩沖液與3份樣品稀釋液混合均勻，在沸水浴中加熱3～5 min使蛋白質變性，在12 000×g下離心5 min，取上層溶液為上樣液。配制13.5%的分離膠(2.25 mL 30%丙烯酰胺(質量濃度)、1.25 mL pH 8.8 三(羥甲基)氨基甲烷(tris-HCl)、50 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(質量濃度)、50 μL 10%過硫酸銨(APS)(質量濃度)、5 μL四甲基乙二胺(TEMED)和1.4 mL雙蒸水)和3.75%濃縮膠(0.313 mL 30%丙烯酰胺(質量濃度)、0.313 mL pH 6.8 tris-HCl、25 μL 10% SDS(質量濃度)、37.5 μL 10% APS(質量濃度)、3.75 μL TEMED和1.813 mL雙蒸水)，完成制膠階段。在電泳槽內加入電極緩沖液(3.03 g tris、18.7 g甘氨酸、1 g SDS定容至1 L)。取7 μL上樣液添加到上樣孔中進行電泳，開始電泳電壓為75 V，當溴酚藍進入分離膠后將電壓調至200 V，電泳40 min。將凝膠從玻璃板取下，在水平搖床中用染色液(1 g考馬斯亮藍R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸定容至1 L)染色2 h。染色后的凝膠用脫色液(甲醇:冰乙酸:雙蒸水的體積比為1∶1∶8)搖床脫色，至蛋白質條帶清晰為止，最后用Chemi Doc-It化學成像系統掃描進行灰度分析。

1.8 數據處理方法

采用Excel 2016對試驗數據進行整理和圖表編輯；采用DPS 9.50統計分析軟件對試驗數據進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 預熱處理對羊乳熱穩定性的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別處理10～60 min，添加TGase使羊乳中TGase濃度達到3 u/g蛋白質，在40 ℃保溫2 h，測定其熱凝固時間(HCT)，結果見圖1。

圖1 預熱處理對羊乳HCT的影響Fig.1 Effect of preheat treatment on HCT of goat milk

由圖1可知，用TGase催化羊乳蛋白交聯提高其熱穩定性與預熱處理條件密切相關，隨著預熱處理溫度的提高和處理時間的延長，羊乳HCT值逐漸增加，熱穩定性提高。但預熱處理條件對羊乳的熱穩定性影響較大，在60～70 ℃預熱處理時，羊乳的HCT緩慢上升；而當預熱處理溫度高于80 ℃時，羊乳的HCT顯著提高，表明預熱處理可有效地提高羊乳的熱穩定性。大量研究表明，乳的熱穩定性與TGase對乳蛋白的交聯度有關，乳蛋白交聯程度越大，乳的熱穩定性越高[18]。但乳蛋白交聯程度與乳蛋白存在狀態有關，尤其是乳中天然存在的球狀乳清蛋白，通常不易被TGase交聯[7]。同時乳中存在天然的TGase抑制劑[19-20]，影響TGase對乳蛋白的交聯效果，預熱處理提高羊乳的熱穩定性可能與TGase抑制劑和乳清蛋白變性有關。

2.2 預熱處理對羊乳中TGase抑制劑的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃分別處理5、10、20、30、60 min后，在羊乳中添加0.01 g/mL的TGase，在37 ℃下保溫15 min，測定羊乳中TGase的活性，計算殘留酶活百分率，并以未經預熱處理的羊乳為對照，結果如圖2。

由圖2可知，當羊乳未經預熱處理時，羊乳中殘留TGase的活性僅為所添加TGase活性的37.4%，表明羊乳中存在天然的TGase抑制劑，抑制TGase對乳蛋白的交聯。然而羊乳經預熱處理后，殘留的酶活性顯著提高，當羊乳在60、70、80、90 ℃下預熱處理5 min后，羊乳中殘留酶活百分率分別達到56.55%、61.27%、78.35%、83.75%，與未經預熱處理的對照組相比，殘留TGase活性分別提高了19.15%、23.87%、40.95%、46.35%，表明羊乳預熱處理可有效滅活羊乳中TGase抑制劑。同時可以看出，羊乳中TGase活性與預熱處理溫度和時間有關，當羊乳在80～90 ℃處理30 min時，羊乳中殘留TGase活性幾乎達到100%，而在60～70 ℃預熱處理60 min時，羊乳中殘留TGase活性才能達到100%，這表明羊乳在80～90 ℃處理30 min或在60～70 ℃處理60 min才完全使羊乳中TGase抑制劑失活。DE JONG[10]報道，牛乳中TGase抑制劑對熱處理敏感，在80 ℃以上熱處理即可使TGase抑制劑滅活，這與本研究結果一致。

圖2 預熱處理對羊乳中TGase殘留酶活的影響Fig.2 Effect of preheat treatment on residual TGase activity in goat milk

2.3 預熱處理對羊乳乳清蛋白變性率的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別預熱處理30 min，測定其乳清蛋白變性率，結果見圖3。

圖3 預熱處理對羊乳乳清蛋白變性率的影響Fig.3 Effect of preheat on the denaturation of whey protein in goat milk

由圖3可知，預熱處理溫度對羊乳乳清蛋白變性率有顯著的影響，隨著預熱溫度的升高，乳清蛋白變性程度顯著提高(P<0.05)。羊乳經60 ℃預熱處理后有12.77%的乳清蛋白變性，而在80 ℃預熱處理后有68.1%的乳清蛋白變性，80～90 ℃處理乳清蛋白變性程度變化不大(P>0.05)。乳中的乳清蛋白是一種熱敏性蛋白質，在80 ℃以上熱處理時極易變性，同時變性的乳清蛋白會與酪蛋白膠束結合，加速乳清蛋白的變性，這種變性的乳清蛋白更有利于TGase的交聯[21]，提高羊乳的熱穩定性。

2.4 預熱處理對羊乳酪蛋白膠束粒徑的影響

將羊乳分別在60、70、80、90 ℃下預熱處理30 min后立即冷卻至40 ℃，添加TGase使其濃度達到3 u/g蛋白質，在40 ℃下保溫2 h，測定羊乳中酪蛋白膠束粒徑，結果如圖4所示。

圖4 預熱處理對羊乳酪蛋白膠束粒徑的影響Fig.4 Effect of preheat on the size of casein micelles of goat milk

由圖4可以看出，未經TGase處理的羊乳酪蛋白膠束平均為117.6 nm，且不受預熱處理的影響(P>0.05)，但羊乳經60～90 ℃預熱處理后，TGase對羊乳中酪蛋白膠束粒徑影響較大，且隨著預熱處理溫度的升高，酪蛋白膠束粒徑逐漸增大(P<0.05)，MARTIN[22]研究表明，乳中酪蛋白在TGase交聯時，僅發生分子內交聯，酪蛋白膠束粒徑無明顯變化，而羊乳經預熱處理時，由于乳清蛋白變性與酪蛋白膠束結合會形成較大的膠束[23]，使TGase交聯后酪蛋白粒徑增大。

2.5 預熱處理對羊乳蛋白質交聯的影響

將羊乳在60、70、80、90 ℃下分別預熱5 min和30 min，添加TGase使其濃度為3 u/g蛋白質，40 ℃保溫2 h，用還原性SDS-PAGE電泳分析預熱處理對TGase催化羊乳蛋白質交聯的影響。

乳的熱穩定性與乳中酪蛋白膠束狀態有關，酪蛋白膠束是由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白構成的復合物，其中κ-酪蛋白位于膠束表面，對膠束穩定性起關鍵作用[24]，當乳經熱處理時，位于表面的κ-酪蛋白易解離，使乳的穩定性降低[21]，但當酪蛋白膠束經TGase交聯后，可使κ-酪蛋白膠束在受熱時穩定，不易從膠束表面脫離，從而提高乳的熱穩定性。SDS-PAGE電泳是將交聯后的酪蛋白膠束解離成單體酪蛋白，反映乳蛋白的交聯程度。羊乳蛋白質在TGase作用下的交聯情況見圖5。

a-SDS-PAGE電泳圖；b-預熱溫度對單體蛋白質相對含量的影響圖5 預熱處理對TGase交聯羊乳蛋白質的影響Fig.5 Effect of preheat treatment on cross-linked goat milk protein with TGase 注：M為標準分子質量，范圍是14.4～116 kDa；1為未經預熱處理和未經TGase處理的脫脂羊乳；2為未預熱處理，但經過3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；3為未經TGase處理，但經過80 ℃ 30 min預熱處理的羊乳；4、5分別為60 ℃預熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；6、7分別為70 ℃預熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；8、9分別為80 ℃預熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳；10、11分別為90 ℃預熱5、30 min，3 u/g TGase在40 ℃下處理2 h的羊乳。

由圖5可以看出，羊乳中的4種酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)和2種乳清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)在SDS-PAGE電泳中，可明顯分離，形成清晰的條帶。同時可以看出，經預熱處理后，TGase交聯形成的高分子質量蛋白條帶。未經預熱處理和未經TGase處理的羊乳(條帶1)與未經預熱處理、但經TGase處理的羊乳(條帶2)相比，其4種酪蛋白和2種乳清蛋白條帶的色度無明顯變化，也未見高分子質量蛋白條帶的形成，同時未經TGase處理、但經預熱處理的羊乳(條帶3)同樣沒有高分子質量蛋白條帶的形成，這進一步證實羊乳中存在天然的TGase抑制劑，抑制TGase對乳蛋白的交聯。但經預熱和TGase同時處理的羊乳中蛋白質組成和高分子質量蛋白條帶有一定變化，表明預熱處理可促進乳蛋白的交聯。

當羊乳經預熱處理后，TGase對羊乳中蛋白的交聯程度有一定的差別，尤其是當羊乳經80 ℃以上預熱處理后(條帶8、9、10、11)，κ-酪蛋白條帶色度明顯降低，同時發現形成的高分子質量條帶明顯增多，而αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白條帶色度變化不大。同時發現乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的色度有不同程度的降低，經條帶灰度分析，羊乳經80 ℃預熱處理30 min時，κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別降低44.86%、31.33%和21.39%，這表明TGase對羊乳中蛋白交聯是有選擇性的，主要交聯羊乳酪蛋白中的κ-酪蛋白和乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。RODRIGUEZ-NOGALES[25]研究表明，乳中酪蛋白對TGase交聯敏感性不同，其中κ-酪蛋白處于酪蛋白膠束表面，易被TGase交聯，而位于酪蛋白膠束內部的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白交聯程度較低，這與本研究結果一致。關于乳清蛋白，由于其球狀結構，通常不易被TGase交聯，但經熱處理時乳清蛋白變性，TGase可使其交聯[26]。RODRIGUEZNOGALES[9]研究表明，當乳經熱處理后，變性的α-乳白蛋白會與β-乳球蛋白形成復合物，然后再與κ-酪蛋白形成聚合物，TGase作用于κ-酪蛋白時，同時也穩定了酪蛋白膠束，提高羊乳的熱穩定性。

3 結論

羊乳經預熱處理后，用TGase對乳蛋白交聯，可顯著提高羊乳的熱穩定性，羊乳中存在天然的TGase抑制劑，在60～70 ℃預熱處理60 min或80～90 ℃預熱處理30 min可使羊乳中TGase抑制劑完全失活，同時，預熱處理可使羊乳中乳清蛋白變性，促使乳蛋白的交聯，提高羊乳的熱穩定性。SDS-PAGE電泳結果顯示，預熱處理可促進TGase與羊乳中κ-酪蛋白的交聯，使κ-酪蛋白在熱處理時不易從酪蛋白膠束表面解離，從而提高羊乳的熱穩定性。