實驗用豬感染模型研究概況

王玉娥, 張 賀, 陳洪巖

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室,

黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室, 哈爾濱 150069)

1 模型動物

為了探索人類疾病的發病機制, 尋找預防及治療方法，評價藥物效果及毒副作用，研究人員常常使用實驗動物作為生物醫學研究的模型。實驗動物作為人類疾病模型的替代者，具備以下特點：能夠正確模擬預期的疾病、存活足夠長時間以獲得預期效果、容易獲得, 且能夠產生大量后代； 同時，可以提供連續和足夠的生物樣本。諾貝爾生理醫學獎設立一百多年來，至少有75個獎項得益于利用實驗動物進行的研究[1]。然而，由于動物的物種進化程度不同，使得不同動物的結構、功能、代謝等生物學特性存在許多相異之處，因此研究工作者不能隨便選用一種實驗動物來做科學研究。此外，由于動物和人類的生活環境不同，研究者在使用實驗動物時應充分了解動物的特性差異，做出恰當的選擇。如果在不適當的動物體內進行實驗，可導致實驗結果的不可靠，甚至使得整個實驗徒勞無功，直接關系到科學研究的質量和成敗, 所以選擇什么樣的實驗動物制作模型進行實驗是生物醫學研究工作中的一個重要環節。

傳統的生物醫學動物模型(如： 果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚和不同嚙齒類動物等)在實驗設施中很容易獲得，常用于研究某種特定基因在人類疫病感染相關生物途徑上的單一影響，但這往往無法代表人類生理機能的復雜性。人類疫病感染模型則需要根據人類疫病的特點來選擇合適的實驗動物模型，使得受試動物能最大程度地復制人類疫病感染所呈現的臨床癥狀、分子途徑、細胞或組織參與的功能障礙等?；蛘咄ㄟ^對實驗動物進行人工誘導或基因修飾，使實驗動物能再現人類疫病感染的部分或全部的發生、發展過程，建立恰當的人類疫病感染動物模型。感染動物模型是研究人類疫病機制、治療、藥物評價等不可或缺的條件。

2 豬是理想的研究人類疾病的模型動物

近年來，人們逐漸意識到一些實驗動物疫病感染模型的局限性，因此盡量選擇與研究對象的機能、代謝、結構及疾病特點相似的實驗動物。一般來講，實驗動物生物學分類地位愈高等、進化愈高級，其機能、代謝及結構愈復雜，反應就愈接近人類。猴、狒狒、猩猩和長臂猿等非人靈長類動物是最近似于人類的理想模型動物。但非人靈長類動物使用成本極高，且存在被廣泛關注的倫理學問題，因此主要被用作人類腦疾病機理和治療方法研究的模型動物。目前，在人類疫病感染模型研究上，小鼠是最廣泛使用的模型動物。然而，通過對免疫系統參數對比分析，研究人員[2]發現小鼠免疫系統與人類免疫系統相似性僅有10%, 相比之下，豬免疫系統與人類相似性超過80%。因此, 在疫病感染模型研究中，除小鼠和非人靈長類動物外，豬被認為是最有價值的臨床前模型動物[3]。目前，豬被廣泛用于醫學教學、心血管病研究、藥物評價和疫病感染模型等領域, 主要原因除了其免疫系統與人類高度相似外,還包括如下幾方面： ①豬與人的重量和器官相似性高； ②豬與人生理和疾病進展(特別是新陳代謝和傳染性)的相似性高； ③豬與人基因組、轉錄組、蛋白質組等數據庫工具的可共用性； ④有效克隆豬的應用, 以及穩定豬細胞系的存在[4]。近年來,隨著豬遺傳學研究及生物技術的迅猛發展[5-9], 使得轉基因豬的培育與轉基因鼠一樣可行[10]。因此，豬作為最理想的模型動物，可用于人類病毒、細菌以及寄生蟲的傳播、感染動力學、組織分布和致病機制等方面的疫病感染模型的研究工作[4]。

目前，豬種群的商業化日趨成熟，且具有多樣化(源于自然或人工選擇)特征，為特定的研究目的提供了使用所需不同表型(或相關基因型)的機會[11]。商業化生產的豬種(如： 大白、長白、大約克夏、杜洛克、漢普夏和皮特蘭等)易于繁殖和生產, 可滿足一般研究需求； 同時, 各種各樣自然選擇獲得的地方豬種或轉基因修飾豬在市場上可以獲取。值得一提的是, 小型豬種由于其體型較小, 具有易于實驗操作、微生物控制、飼養成本低等優點, 逐漸成為生物醫學模型研究中的重要實驗動物。明尼蘇達霍麥爾系小型豬和哥廷根系小型豬是歐美常用的小型豬實驗動物品系。近年來, 我國開發了藏香豬、五指山小型豬、巴馬香豬、西雙版納小型豬、貴州小型豬、滇南小耳豬和臺灣小型豬等實驗小型豬[12；13]。巴馬香豬和五指山小型豬已經在國內得到廣泛使用。

3 豬作為研究人類病原體傳染病的模型動物

豬已經被用作與人類健康相關的諸多傳染病的模型[14,15]，這些模型主要包括三類：第一類為自然疾病模型，即自然界存在與人類病原體密切相關或完全相同的豬病原體，以此為感染模型研究人類相似病原體的發病特點及機制等；第二類是在實驗條件下，將人類病原體傳給豬，使得受試動物在一定程度上可模擬人類疾病特征，具有一定實驗性的替代感染模型； 第三種是使用轉基因技術獲得轉基因豬，使得原本不能感染豬的人類病原體能夠在轉基因豬體內感染復制，獲得人類特有病原體的感染模型。目前，運用豬作為模型動物已成功建立了多種人類病原體感染模型，下面以病原體種類分別進行總結。

3.1 病毒感染模型

甲型流感病毒(IAV)可感染多種宿主，包括人類、豬和各種鳥類等。即使目前在使用疫苗情況下，人類的流感疾病仍然每年爆發，而且流感病毒在人類身上的發病機理和傳播機制還不是很清楚。豬是流感病毒的自然宿主，在新流感病毒的出現、流行和傳播中起著至關重要的作用。豬流感病毒感染與人類有許多相似之處，如相同的病毒亞型在這兩個物種中都是地方性的，病毒在這兩種宿主之間反復交替出現，人類和豬在感染IAV 后臨床表現和發病機理是相似的，并且在呼吸道中也有類似的IAV 受體分布[16]?？紤]到這些共同特征，豬被認為是IAV 感染研究的合適和有價值的模型。研究[17]發現，以基質蛋白胞外功能區(M2e)表位為基礎的亞單位疫苗鼻內接種豬只后，能有效保護豬只免受同源性病毒攻擊，宏觀和微觀損傷均減少，臨床癥狀減輕，鼻分泌物和唾液中的病毒量顯著降低。Kiyoko 等[18]利用小型豬作為IAV 感染模型，研究發現豬呼吸道存在病毒的傳統受體SAα2,3Gal 和SAα2,6Gal，使得該小型豬與傳統商品化豬對病毒的易感性相似，可作為新型IAV 感染的動物模型。

阿爾法皰疹病毒，如豬的偽狂犬病毒(PRV)和人類的1型單純皰疹病毒(HSV-1)，已經與宿主共同進化。病毒與上皮屏障和免疫系統的相互作用促進了宿主屏障適應和免疫反應。由于阿爾法皰疹病毒不會在嚙齒動物中傳播，因此嚙齒動物不能被用作同源模型，而帶有PRV的豬是合適的同源模型，能夠用于研究阿爾法皰疹病毒與宿主的相互作用，以鑒定免疫逃避途徑進而篩選阻止病毒復制的藥物新靶點[18]。阿爾法皰疹病毒感染豬模型的研究[19]表明，PRV 與病毒復制主要部位的鼻黏膜相互作用，與HSV-1 非常相似。該病毒首先在上皮細胞中復制，激活細胞絲氨酸蛋白酶，在基底膜上鉆洞，從而使病毒通過上皮細胞屏障，迅速擴散到黏膜和黏膜下層。之后，阿爾法皰疹病毒沿著軸突傳播到感覺神經元的神經元細胞體。該研究還發現，干擾素α(IFN-α）在PRV和HSV-1-感染的神經元中促進了病毒的潛在感染階段。

戊型肝炎病毒(HEV)是已知的5種人類肝炎病毒之一，與其他肝炎病毒相比，擁有獨一無二的多種儲存宿主，是重要的人獸共患病之一。盡管非人靈長類動物是最常用于研究HEV感染的動物模型，但豬作為HEV基因3型和4型的天然宿主，已經被成功地用于闡明HEV基因的結構和功能關系, 及HEV 復制機制的研究[20]。Cao 等[21]開展了一種HEV感染豬模型的研究，并檢測了導致慢性疾病發生的免疫相關因素，研究表明用免疫抑制劑，包括環孢霉素、阿扎匹林和潑尼松龍, 處理模型動物豬，造成的免疫系統損傷情況與HEV感染造成人類免疫缺陷進而發展成慢性疾病相似。

寨卡病毒(ZIKV)是一種蟲媒傳播的病毒，2014 年2 月在智利首次發現該病毒感染病例。孕婦感染ZIKV 后自身癥狀表現輕微，但孕婦分娩的后代多呈現畸形，即在胎兒和新生兒中出現異常發育和嚴重的腦損傷。同時，人們擔心，在子宮內和出生時沒有明顯癥狀的后代可能會患上精神疾病，因此需要發現合適的動物模型測試ZIKV 感染對嬰兒腦組織損傷情況，判定無癥狀后代的健康與否。為了模擬病毒在人子宮內的感染情況， Darbellay等[22]給妊娠母豬接種了ZIKV，結果表明病毒可通過胎盤屏障造成胎兒感染，并產生持續感染、胎兒大腦中的分子病理變化、胎兒抗體和IFN-α 反應特征。感染ZIKV 妊娠母豬的后代在出生后的胎兒膜中存在ZIKV。一些產后仔豬個頭很小、精神沉郁、腦容量不足，并且表現出癲癇癥狀；一些仔豬則表現出潛在的活躍度升高狀況。子宮內感染ZIKV 的豬模型具有很大的轉化研究潛力，可以用于模擬測試孕婦感染ZIKV 的治療干預措施是否可行。

轉矩塔諾河病毒(TTSuV)可感染多種脊椎動物。盡管有流行病學證據[23]表明與人類疾病有關聯, 但一直以來TTSuV 感染并沒有與特定疾病聯系在一起。最近，人們發現[24]豬身上也存在自然發生的TTSuV感染，且感染情況與人類TTSuV有諸多相似之處，這增加了使用豬作為研究人類TTSuV 感染模型的可能性。這種方法將需要開發新的調查工具來研究流行病學、傳播、免疫反應以及TTSuV感染的潛在發病機制。 Kekarainen等[25]總結了動物TTSuV感染的研究，重點關注豬的TTSuV感染，并考慮了豬實驗感染模型如何幫助研究人類TTSuV 感染。

腸道病毒71(EV71)是造成人類手足口病的病原，通常與嚴重的、甚至是致命的神經系統和呼吸系統疾病有關。隨著脊髓灰質炎病毒在世界大部分地區的根除，EV71 是目前最重要的神經毒性腸病毒。每年有100 多萬例手足口病病例和數百例嬰兒和幼兒死亡，其中6 個月至23 個月的兒童發病率和死亡率最高[26,27]。然而，EV71 的疫苗開發和發病機理研究因缺乏合適的動物模型受到限制。Yang 等[28]通過體外和體內研究發現，新生無菌豬可以通過口服和口服-鼻腔接種感染新分離的神經毒性EV71 BJ110 毒株。病毒感染導致豬只出現了一些人手足口病發病的臨床特征，包括神經系統和呼吸系統的癥狀，這些癥狀模擬了嬰兒感染EV71 疾病的癥狀；同時，血清中EV71高效價的中和抗體也在口服和聯合口鼻接種感染的豬中誘導產生。上述研究結果表明，新生無菌豬代表了一種具有前景的新型動物模型，可用于對EV71 疫苗和抗病毒藥物進行臨床前評估。

3.2 細菌感染模型

由金黃色葡萄球菌引起的敗血癥嚴重影響了全世界人類的健康問題[29]。隨著青霉素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌對青霉素產生耐藥性，被命名為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，現已成為臨床上常見的毒性較強的重要病原菌之一[30]。豬被認為是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的來源。由于金黃色葡萄球菌所能參與的疾病范圍較廣，豬被用于該細菌的多種感染模型研究，包括傷口感染、骨髓炎、肺炎和敗血癥等[31-33]。金黃色葡萄球菌感染后，在8 周齡的豬體模型上出現了骨髓炎的病變，這與在青春期前兒童身上出現的骨髓樣病變相似。

肺炎鏈球菌是在人鼻咽部攜帶的一種革蘭氏陽性細菌，可在人與人之間傳播，引起不同的疾病，如中耳炎和鼻竇炎，甚至引起更為嚴重的疾病，包括肺炎、腦膜炎和敗血癥[34,35]。仔豬感染肺炎鏈球菌的發病機理與人肺炎鏈球菌病的發病機理有驚人的相似之處，因此豬可作為研究人類肺炎鏈球菌定植和侵襲性疾病的動物模型。研究發現[36]，靜脈注射致病性肺炎球菌，2 d 后細菌在仔豬體內明顯復制，5 d 后豬仔出現菌血癥，且菌血癥通常與發熱和敗血性關節炎緊密相關。此外，仔豬鼻內注射肺炎鏈球菌菌株后，連續6 d 可檢測到定居的菌株。仔豬作為動物模型不但可以用于模擬人肺炎球菌感染產生的核心問題，還可以用于對肺炎感染和侵入性疾病的研究，也可以用于改進肺炎鏈球菌疫苗的開發。

百日咳是一種由百日咳桿菌引起人類急性呼吸道傳染病, 5 歲以內小兒易感性最高。Elahi 等[37]研究發現，在實驗條件下百日咳桿菌感染新生仔豬誘發的臨床癥狀和病理變化與嬰兒患病相似，包括初乳和母乳中母源抗體的測定，以及病原抵達黏膜免疫間隙的研究。利用豬感染模型，研究者[38]發現母源抗體在保護機體免受百日咳感染中發揮重要作用，因此豬成為檢測小兒百日咳疫苗效力最有價值的模型動物。同樣，副百日咳博德特桿菌也是引起人類急性呼吸道傳染病的病原，也可以感染日齡較大的豬只。副百日咳博德特桿菌具有抑制感染豬只天然免疫防御的能力，但是該細菌抑制天然免疫的能力在呼吸道中可被防御素所中和[39]，使得豬成為進一步揭示百日咳致病及免疫機制的模型動物。

3.3 寄生蟲感染模型

由于剛地弓形蟲(弓形蟲)能夠長期感染包括人類在內的所有溫血動物，使得弓形蟲成為世界上最普遍的寄生蟲之一。弓形蟲的終端宿主是貓科動物, 其在宿主體內的終生存在增加了它的傳播機會。終端宿主將弓形蟲卵囊排入環境后, 污染土壤、食物或水等； 中間宿主(如： 鼠、豬或人類)則通過接觸污染的環境被弓形蟲感染[40-42]。與小鼠相比, 豬感染弓形蟲后的疾病發生發展過程與人弓形蟲病更加相似。例如, 在豬和人類中, 弓形蟲感染的嚴重程度、經胎盤傳播和干擾素誘導的抗寄生蟲效應機制是相似的。此外, 在小鼠身上所描述的急性弓形蟲感染期間的嚴重免疫抑制現象并不發生在感染的人和實驗感染的豬身上。因此, 豬弓形蟲感染數據更能代表人類弓形蟲病[43]。

豬有與人類非常相似的皮膚系統和眼部結構，He 等[44]成功運用Yucatan 小型豬模型研究了人類寄生蟲病——棘阿米巴角膜炎，研究表明，小型豬感染棘阿米巴原蟲后產生的病變與人類的病變相似，包括眼睛呈現密集的白色環狀浸潤、間質水腫和角膜炎。豬的病變和感染的慢性特性，以及豬與人類眼睛的解剖學相似性，使豬模型成為研究角膜炎的細胞生物學、宿主免疫反應和潛在療法的重要補充。

3.4 豬作為研究自身病原體感染的模型

傳統的豬傳染病模型研究用豬通常是從商品化的健康養殖系統中采購，獲得渠道簡便易行。然而，在豬的病原傳染病研究中，獲得感興趣的病原體和抗體陰性豬是至關重要的。在此基礎上,多種豬傳染病模型均已建立, 能夠成功模擬豬只在自然發病情況下的感染癥狀, 可用于病原體致病機制及宿主免疫應答的研究, 同時可作為評價防治豬傳染病生物制劑功效的標準感染模型。如非洲豬瘟(ASF), 是豬的一種高傳染性病毒性疾病, 可導致死亡率高達100%[45]。Galindo-Cardiel 等[46]建立了標準化的攻毒方案, 對不同病毒株和疫苗樣病毒感染后產生的臨床學、病理學和免疫應答特性的進行了詳細分析, 為ASF 疫苗研究提供了良好平臺。同樣, Lacasta 等[47]研究發現, ASFV 強毒株感染豬只產生的病理變化和免疫應答與弱毒株差異顯著，對研制有效的ASF 疫苗具有重要意義。

此外，如果新鑒定的或變異的豬病原體和相應抗體檢測方法不存在，或某些豬源病原體難以根除，使得無法建立這些病原的感染模型。目前, 有幾種方法可以克服上述感染模型無法建立的問題： ①對常規豬的抗原和某些病原體抗體進行檢測，篩選獲得陰性豬，在隔離環境中飼養并進行實時監測，進而獲得無特定病原體(SPF)豬； ②采用自然分娩后不飼喂初乳的方法獲得自然分娩不喂母乳(NFCD)豬； ③剖宮產飼喂初乳方法獲得剖宮產不喂母乳(CDCD)豬； ④無菌法或無菌技術獲得無菌豬或悉生豬。SPF 方法的優點是獲取方便、技術要求低和成本低。然而，當需要豬群流行病原體陰性時, 例如豬圓環病毒2 型(PCV2)，這種方法可行性很低, 因為大多數豬都有針對PCV2 的抗體, 要么是母源的，要么是被動免疫，要么是被感染的病原體誘導產生的。因此，研究人員不得不通過大量的農場進行篩選，以獲得可靠的豬源。CDCD 豬、無菌豬或悉生豬是獲得感染模型的最佳選擇，但是由于試驗條件的要求和成本較高，使得實際應用存在一定局限性[48,17]。

Liu 等[49]利用NFCD 豬作為研究工具，構建了PCV2 和副嗜血桿菌4型(HPS4)聯合感染動物模型，研究表明，PCV2 和HPS4 單獨感染動物時，均產生病毒血癥或菌血癥，聯合感染仔豬出現多系統衰竭綜合征，包括呼吸困難、厭食、虛脫和體質量嚴重減輕。PCV2 和HPS4聯合感染導致了血清和組織中病毒含量增加，針對PCV2 的抗體產生較慢且較低。PCV2 和HPS4聯合感染導致了總的和分化的外周血白細胞數量進一步減少。HPS4共感染增強了PCV2相關的肺臟和淋巴結病變的嚴重程度，增加了PCV2 抗原的毒性，提高了仔豬多系統衰竭綜合征的發生率。該研究證實NFCD 成為豬病原體感染的有價值的動物模型。

4 小結與展望

除了危害人類健康的心腦血管疾病和惡性腫瘤外，傳染性疾病成為影響人類健康的主要威脅。為了探尋傳染性疾病的發病機制，研發預防性疫苗，評價藥物治療效果，急需根據人類疾病的特殊性來選擇研究模型，并盡可能復制與功能障礙相關的臨床癥狀、細胞或組織、分子變化等。選擇合適的動物模型并構建接近于人類疫病感染的動物模型是疫病感染研究的基礎和前提。世界上幾乎所有的地理區域，豬成為食物、蛋白質和脂肪來源已有幾個世紀，利用豬與人類的相似之處，并結合先進的研究技術如蛋白質組、基因組等組學，以豬作為動物模型來深入開展人類疾病的研究具有巨大優勢。