Foxp2 小鼠模型中發育性言語障礙的分子遺傳學研究

李 慧

(北京師范大學珠海分校, 珠海 519080)

語言的生成和理解是人類特有的能力，是社會和文化不可分割的一部分。近二十年來，從分子角度對語言產生的神經機制進行了全面研究。最初的工作是發現與言語、語言或閱讀相關的基因組變異和基因損傷。第1 例發現的相關基因是叉頭框P2 基因(forkhead box P2, FOXP2)，它編碼轉錄因子，其突變會導致嚴重的神經發育言語和語言障礙[1]。鑒定FOXP2 與其它候選基因可在分子機制層面提供至關重要的信息，而目前的挑戰是確定它們編碼的蛋白質如何影響支持人類言語的大腦回路。

神經生物學和認知神經科學的研究[2]發現，言語和語言技能取決于皮質和亞皮質的多套神經回路的活性。構成人類語言機能的組件(如記憶、聽覺意識和運動控制等)與其它脊椎動物廣泛共享，且分子生物學研究[2]發現，言語和語言相關基因也在具有習得性發聲行為的其他物種中存在，且通常有著“深同源性”。因此，人類言語很可能部分建立于參與感覺運動整合和運動技能學習的祖先腦網絡的基礎之上，對于其他物種中FOXP2等基因的直系同源物的研究顯然非常有價值。以下著重討論基因操作小鼠模型中的相關研究及發現。

1 FOXP2 基因簡介

FOXP2是研究英國一個多世代家族(KE家族)所獲知的第1 例參與言語和語言的基因[3]，該家族中約半數(15人)持有FOXP2雜合突變, 導致1個氨基酸被替代，從而影響了所編碼蛋白質調控靶基因的能力[4]。除了包含FOXP2 基因在內的大范圍染色體缺失外，與語言能力有關的多種FOXP2突變(如錯義突變、無義突變和轉位斷點)也在各種人群中被證實過[5]。與FOXP2 基因損傷有關的一個共同特征是： 不能精確和穩定地控制流暢言語所需的運動協調性和運動順序，被稱為發育性言語運動障礙(developmental verbal dyspraxia，DVD)或兒童言語失用(childhood apraxia of speech, CAS)。患病人群所犯的言語錯誤每句話之間各不相同，隨著話語復雜度的增加錯誤更加嚴重。除了DVD/CAS外, 其它表達性和感受性的損傷也存在,影響口頭和書面語言[5]。當基因組破壞主要影響FOXP2 時, 認知的非言語部分相對不受影響[5]。對KE 家族的神經影像學研究表明，在尾狀核、額下回(包括Broca區)和小腦腹側有微小而嚴重的結構異常。功能磁共振成像(MRI)顯示在語言任務中，KE 家族成員的皮質內核、Broca 區和羅蘭迪克島蓋激活不足。這些區域與FOXP2 的高表達位點(包括皮質、基底神經節、丘腦、下橄欖體和小腦)一致[3]。以上研究顯示FOXP2 影響參與言語和運動控制的腦區，言語相關的神經回路與其它運動過程相關的神經回路廣泛重疊。

在所編碼蛋白的序列及神經系統中的表達模式上，小鼠Foxp2 與人FOXP2 高度相似，始于胚胎期的表達一直持續到成年期[6]。目前已獲得Foxp2 基因受破壞的幾種小鼠系列，包括導致Foxp2蛋白缺失的突變體以及重現了在KE家族中發現的無義突變的小鼠系列[2]。完全缺乏Foxp2或只有非功能蛋白的純合子小鼠發育遲緩或有嚴重的運動損傷，在3～4 周齡時死亡。相反，雜合子小鼠存活到成年期且看起來明顯正常[7]。具有KE家族雜合無義突變的小鼠在超聲音節的聲學結構上沒有變化，但所產生的序列更短，且在社交環境中不能向更復雜的句法轉換，從而推斷，盡管小鼠的超聲發聲是內源性的，但Foxp2 對發聲序列的作用在小鼠與人類中是保守的[8]。

2 分子網絡

對妊娠中期的胎鼠腦進行大規模的染色質免疫沉淀和表達譜分析[9], 發現了神經發育期間Foxp2所調控的基因網絡, 為所影響的生物過程提供了線索。此工作鑒定出的靶基因, 突顯了它們在調控神經細胞突起生長和突觸可塑性的潛在作用。如今, 研究的注意力轉向Foxp2 本身如何受到調控。例如一項研究[10]報道, miRNAs(miR-9和miR-32)抑制Foxp2 表達，影響神經細胞突起生長和皮質投射神經元的輻射性遷移。受Foxp2 調控的基因——接觸蛋白關聯蛋白樣蛋白2(CNTNAP2), 與包含語言缺陷在內的神經發育障礙相關, 甚至與普通人群之間的語言發育變化相關[11]。其他Foxp2 的靶點和相互作用組也參與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥、躁郁癥、癲癇和智力殘疾。含sushi 重復蛋白X 連鎖2 基因(SRPX2)是其中一個靶基因, 它的突變將導致腦中言語相關區域的癲癇和DVD/CAS。SRPX2 抑制會損傷突觸發生, 導致出生7日齡(P7)仔小鼠超聲發聲減少[12]。SPRX2 基因敲除初生小鼠表現超聲發聲個體異常和社交興趣減少,表明SPRX2 在聲音發育和社交回路中的作用[13]。在小鼠紋狀體中，Foxp2 與突觸抑制基因肌細胞增強子2C(Mef2c)負向互動。Mef2c 抑制皮質紋狀體突觸形成和樹突棘形成，但本身又受到Foxp2 的抑制。Foxp2 缺失去抑制Mef2c, 紋狀體內及整體性Mef2c 減少則可挽救由Foxp2 缺失突變帶來的發聲和紋狀體樹突棘的缺陷。因此Foxp2-Mef2C信號通路對皮質-紋狀體回路的形成非常關鍵，人體中這一信號通路的缺陷可能促成一系列的神經精神障礙[14]。腦皮層中Foxp2 純合突變導致淀粉樣βA4 前體蛋白結合家族A 成員2(Apba2)表達下調, 該基因參與小鼠的趨向行為以及人類的自閉癥譜系障礙[15]。這些數據共同暗示了跨越診斷界線的共同的分子和神經回路機制。然而仍不清楚靶點的調控具有細胞類型特異性還是腦區域特異性, 且尚不明確靶點的異常調控對整個生物體有什么影響。

3 Foxp2 基因與感覺處理

Foxp2 在參與感覺處理和整合的皮質和亞皮質區中表達。嗅覺系統中, 其表達發生在嗅球小球層、附屬嗅球和嗅結節。Foxp2 也在丘腦軀體感受區及上行的聽覺和視覺中繼核團中表達。皮質區內, Foxp2 在VI 層表達廣泛, 在V層的表達則主要局限于聯合區和運動前區[6]。迄今為止所做工作主要集中于聽覺系統。小鼠中Foxp2 在丘腦內側膝體核的表達與聽覺體驗相關。Kurt 等[16]發現，Foxp2-R552H雜合子(與KE家族突變相同)比起對照組來說有更長潛伏期和更小振幅的聽覺腦干反應(ABRs)，ABRs 能反映激活神經元數量或同步性的變化。然而Foxp2-S321X 雜合子(有一半劑量的功能FOXP2蛋白質)的ABRs與野生型幼仔沒有顯著差異。Foxp2-R552H 和Foxp2-S321X 雜合子都顯示出更慢的聽覺-運動聯合的學習過程(由穿梭箱條件性回避實驗系統評估), 然而盡管Foxp2-S321X 小鼠有正常的ABRs，它們的聽覺運動學習卻存在更嚴重的缺陷[17]。

4 Foxp2 基因與運動技能學習

Foxp2表達于與運動技能相關的皮質-紋狀體和皮質-小腦回路。其中，小腦內的表達局限于浦肯野細胞和深小腦核，并在延髓的下橄欖核中強烈表達[6]。紋狀體內Foxp2 的表達富集于紋狀小體中[14]。且在含多巴胺受體1(DRD1)的中型多棘神經元(MSNs)中表達水平更高[18]。Foxp2 也存在于黑質致密部、腹側被蓋區和丘腦下核，可能在動機與運動輸出的整合中發揮作用[6]。如上所述，Foxp2 純合子突變體顯示了更加嚴重的運動功能障礙和出生后致死率，而雜合子可存活，看起來大體正常。然而，對有正常運動能力的Foxp2-R552H 雜合子的分析[19]發現，它們在加速的轉棒和自動轉輪系統上存在學習缺陷。這些對運動技能學習和表現的影響比起人類FOXP2基因損傷的結果更為廣泛，這些不同的發現可能反映了FOXP2功能的物種差異。在人類和小鼠中開發新的行為任務或者細致分析現有任務將有助于確定哪些運動技能學習特征正在受影響，例如速度、精確度或變化性。

對皮質-紋狀體回路的針對性研究[20]表明，Foxp2-KO雜合子中的紋狀體多巴胺水平增加而樹突長度減小, Foxp2-R552H 雜合子中皮質-紋狀體突觸的長時程抑制(LTD)受損[19]。對在加速旋轉輪上訓練的Foxp2-R552H 雜合小鼠的體內電生理記錄發現異常高的紋狀體活性[21]。Foxp2 雜合突變體在表達DRD1的MSNs中增加了GABA受體介導的抑制型電流, 從而增加了紋狀體直接通路的抑制[22]。與上述研究結果相反, Enard 等[20]發現該基因被部分人源化的Foxp2-Hum純合子有升高的皮質-紋狀體LTD，在運動技能學習中沒有檢測到差異。這些鼠在皮質、紋狀體和丘腦中(不在小腦中)有更長的樹突, 因此推測發生在人類世系中的FOXP2 中的氨基酸變化特異地影響皮質-紋狀體回路。盡管Foxp2-Hum 純合子和雜合子突變小鼠都有正常的生育能力和生命期限, 但它們的紋狀體和相關的皮質基底核回路中存在顯著的神經化學、神經生理學和神經解剖學變化, 這些回路是運動和認知行為所必需的[23]。Schreiweis 等[24]在Foxp2-Hum 純合突變成年小鼠中分析紋狀體三個亞區(腹側紋狀體、背外側紋狀體和背內側紋狀體)以及各亞區紋狀小體和Matrix間區的Foxp2的表達，發現Foxp2 人源化突變會以區域和間區特異的方式顯著影響Foxp2high(Foxp2 呈高表達水平)的神經元的分布。背側紋狀體中僅在紋狀小體間區內Foxp2high神經元的密度增加了2 倍，而在腹側紋狀體中的Matrix 區間才出現了Foxp2high神經元密度增加的現象。由于紋狀體不同亞區參與腦學習活動的不同階段，紋狀小體和Matrix 區間也在發育、連接性和功能方面有所不同，因此作者推測這樣一種區域-間區特異的改變一定會有特定的行為效應，如實驗室中顯示的Foxp2 人源化會損傷小鼠紋狀體依賴的嗎啡行為敏感化。

Foxp2-Hum純合突變成年小鼠的超聲發聲的結構和使用不受影響[25]，這與之前許多研究顯示的“小鼠超聲發聲幾乎不受發聲學習的影響”的結論一致。

在小腦中，Foxp2-R552H 雜合鼠在平行纖維浦肯野細胞突觸中顯示了微妙的電生理變化[19]。Usui 等[26]通過體外免疫共沉淀和體內共定位實驗發現初生小鼠小腦中Foxp2的類泛素化修飾調控浦肯野細胞的發育、運動功能和發聲交流。然而在此領域開展了相對較少的工作。如今通過使用條件性基因敲除等策略使Foxp2區域特異性缺失變得可能, 對解釋該基因在不同回路中的作用以及正確解釋Foxp2 缺失后的紋狀體和小腦異常很重要。

Castellucci等[27]追蹤幼年到成年Foxp2雜合突變小鼠發現, 其求偶歌曲中有嚴重的異常, 包括發聲減少、音節序列更短和節奏不規則, 說明Foxp2在幼年和成年小鼠的發聲運動控制中發揮關鍵作用。幼年斑胸草雀的紋狀體X 區中，miR-9 過度表達所伴隨的FoxP2 表達下調, 會導致音節省略、歌曲模仿不精確等鳴唱損傷[28]。Adam 等[29]通過使用慢病毒載體在斑胸草雀X 區下調FoxP2 的表達，發現孤獨癥相關基因CNTNAP2 表達也隨之減少。此外由于年齡或鳴唱原因導致的FoxP2 下調也會導致CNTNAP2 表達的下調。體外實驗也證明, FoxP2 激活CNTNAP2 啟動子。鳴禽中的研究證明, CNTNAP2 是FoxP2 的直接目標基因, 可能會影響與鳴曲學習和維持相關的突觸功能。

5 展望

對人類、小鼠、鳴禽和其它物種中FOXP2直系同源物的研究將極大地促進對其神經功能的理解。神經細胞突起生長和突觸可塑性是FOXP2靶點所深度參與的兩個過程。這些研究結果已在活體內確認FOXP2缺失導致運動技能學習和感覺運動整合的缺陷以及異常的紋狀體可塑性。小鼠模型是高度有效的基因操作系統, 可從分子、細胞、形態學、發育、電生理和行為等多方面研究人類病因。基因操作可能局限于特定的腦區、細胞類型或發育時間點, 而今后對行為微結構更詳細的研究配以更復雜的分析方法將有助于解釋微妙表型的紛繁復雜。小鼠研究的獨特優勢在于所能利用的遺傳、分子和電生理工具的范圍更廣。目前有對動物遺傳上確定的神經回路的神經活動進行成像和記錄的技術，而且可在這些回路中利用光電子技術操作其活性。把這些技術利用于Foxp2基因損傷小鼠將充分利用該物種作為實驗系統的優勢, 闡明該基因對人類言語和語言的貢獻。

除了研究基因功能障礙帶來的語言影響，小鼠也可用來評估人類進化中潛在的表型效應。語言和直立行走等人類的基本特征, 與顱面成型與骨骼重塑等一系列解剖結構變化有關。然而人類進化中這些形態特征如何出現尚不明晰。Xu 等[30]通過分析骨骼特異的Foxp2 基因敲除小鼠，鑒定了Foxp2 在顱面成型與骨骼重塑中的作用，發現Foxp2 有助于調控后肢的力量與長度，維持關節軟骨和椎間盤，這些都是適應于直立運動的解剖特征。考慮到Foxp2 在運動技能和言語相關腦回路中的作用，可推測該基因也促進言語和直立運動相關的神經結構和解剖結構的協同進化。

考慮到人類語言的復雜性以及言語和語言障礙的多樣性，單種動物模型無法全面揭示其神經機制，需在呈現復雜聲音行為的鳴禽和其他物種中引入更先進的遺傳研究手段，例如在非人類靈長物中研究聲音回路是一個迅速發展的領域。日本為期十年的腦研究計劃(Brain/MINDS)專注于對狨猴的研究。Takahashi 等[31]通過對狨猴的研究發現，正常的聲音發育可能受到父母反饋的影響。通過對遺傳性言語障礙個體的基因掃描，已發現一系列與言語/社交/認知相關的基因(如： FOXP2,CNTNAP2, FOXP1, GNPTAB, GNPTG, NAGPA)，且在動物模型中得到研究。隨著分子生物技術的不斷發展，例如高通量基因分型和下一代全基因組測序技術的應用，將進一步闡明語言相關疾病(如言語失用、特殊語言障礙、發育型讀寫障礙)的遺傳基礎。