生物及天然保鮮劑在葡萄采后灰霉病控制中應用的研究進展

成培芳，馬曉芳，云雪艷，王莉梅，胡 健，董同力嘎

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)，葡萄屬(Vitis L.)，是僅次于柑橘的世界第二大漿果類水果。葡萄因含有豐富的活性物質而具有較高的營養和食療價值，因此，深受廣大消費者的喜愛［1］。然而由于葡萄果實皮薄，柔軟且汁液多，因此極易受到微生物的侵害，其中，最常見、危害最嚴重的病害是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病。該病原菌一旦存在，即使在低溫條件下(－0.5℃)也可以迅速傳播并擴散至整串葡萄漿果，導致整個漿果的最終腐敗，從而失去食用價值和商品價值。每年因灰霉病造成的葡萄產后損失高達20%以上［1］，成為葡萄采后長距離貯運和貨架保鮮過程中主要的限制性障礙。

過去的幾十年，葡萄在采后貯運過程中，常先采用特克多(噻菌靈)等化學藥劑浸果后再進行貯藏［2］。然而，化學農藥的長期使用使得病原菌對農藥逐漸產生很強的抗藥性，最終難以徹底有效控制病害的發生和發展。同時，隨著消費者健康和環保意識的不斷增強，農藥殘留引發的人體安全問題以及農藥污染引起的環境污染問題逐漸受到人們的廣泛關注［3］。世界各國普遍使用的貯藏方法就是冷藏結合SO2的熏蒸處理或SO2的逐步釋放等保鮮措施，來管理和控制灰霉病的發生［4－5］，并且在幾十年的實踐過程中發現，SO2氣體對于灰霉菌有很好的抑制作用［6］，例如在密閉環境中進行氣態SO2熏蒸處理或采用可釋放SO2的保鮮(片材)小袋，均可顯著地控制采后葡萄灰霉病的發生發展，但是，對于一些如紅地球等不耐SO2的葡萄品種來說，如果在保鮮過程中SO2的使用劑量控制不當，則會引起葡萄漿果表面不同程度的漂白現象［7］，嚴重的甚至會加速葡萄的霉變腐爛。例如，Zoffoli等［8］的研究發現，當氣態 SO2的釋放量超過3 mL·L－1·h－1，就會在葡萄漿果表面誘導產生一些用肉眼看不到的縱向微細裂紋，從而使葡萄在貯藏過程中汁液不斷滲出，加速葡萄漿果的霉變腐爛，同時對葡萄的風味也會產生影響［9］。因此，在使用SO2緩釋墊進行葡萄采后灰霉病抑制的過程中，SO2最佳釋放量的研究，一直是研究的重點和難點。同時，有機葡萄生產工藝已不再允許SO2和化學殺菌劑作為葡萄的采后處理方法［10－11］。此外，隨著人們對無殘留農藥果蔬呼聲的日益高漲以及有機農業對SO2化學保鮮劑的種種限制，研究和開發高效、環保的可替代SO2型化學保鮮劑用于控制采后灰霉病的新型保鮮技術已成為科研人員研究的熱點和重點。

本文闡述了葡萄灰霉病特征及葡萄采后灰霉病的發病癥狀，綜述了SO2替代型生物控制和天然保鮮劑的研究現狀與發展前景，以期為今后葡萄采后灰霉病的無公害防治和葡萄貯藏保鮮的實際生產應用提供參考。

1 葡萄灰霉病特征及發病癥狀

1.1 葡萄灰霉病特征

葡萄灰霉病主要是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的，灰葡萄孢菌是葡萄孢屬中的一類絲狀子囊腐植營養型真菌，屬半知菌亞門絲孢目葡萄孢屬［12］。它們以壞死組織為營養，能殺死植物細胞，并在植物的壞死組織上生長發育，其寄主范圍十分廣泛，能夠引起200多種雙子葉作物和一些觀賞花卉感染灰霉病?；移咸焰呔哂卸喾N感染模式，能以菌絲、分生孢子及菌核的形式感染［13］。分生孢子梗具有梗細長，頂端細胞可膨大生成許多小梗的特性，而分生孢子是單胞，分布于小梗上而聚集成葡萄果穗狀。因此，當菌絲處于不利環境時，就會形成菌核，然后在2～25℃條件下萌發產生分生孢子梗和分生孢子。

灰葡萄孢菌的生長繁殖具有不確定性和不固定周期性，可在不同生長時期、不同溫度下感染不同的植株，感染速度較快，因此，葡萄采后灰霉病的感染存在多種可能，可能是早期果實的感染所致，也可能是成熟期直接感染，這就給采后灰霉病的防治帶來了不確定因素，從而增加了防治難度。

1.2 葡萄采后灰霉病的發病癥狀

貯藏階段，漿果染病早期在果皮上出現直徑2～3 mm的圓形凹陷病斑，果肉仍維持原有硬度，病斑顏色稍淺于周圍的正常組織。用手輕擦病斑部位，可見表皮易與果肉分離而發生局部脫落，如果用手按壓病斑則病處表皮破裂果肉暴露。葡萄一旦染病后病程發展十分迅速、難以控制。在適宜發病的環境條件下幾天后即發生落粒和果實軟腐，果皮上開始聚積并產生大量灰至淺黃色的菌絲和分生孢子，使果實完全失去商品價值。

2 葡萄采后灰霉病防治的替代型保鮮劑

2.1 生物控制劑及其復合技術

近年來，為了減少和避免化學殺菌劑帶來的健康隱患和環境污染問題，相關文獻表明，在生物環境中，利用拮抗微生物進行的生物控制技術在果蔬采后灰霉病的控制方面較傳統的化學防腐劑有很大的優勢［14－15］。例如，Parafati等［16］研究顯示不同種類的酵母菌生物防治劑可不同程度地抑制葡萄漿果采后的發病率、發病程度及病變直徑，是一項很有發展潛力的“無硫”保鮮劑。其中常用的生物防治劑主要有生物真菌和生物細菌防治劑。生物防治的保鮮機理主要是微生物可通過拮抗(Antibiosis)、競爭(Competition)、誘導抗性(Induced resistance)等一種或多種機制聯合來抑制其它微生物的生長［17］。范三紅等［18］的研究表明，洋蔥霍爾德氏菌(Burkholderia contaminans B－1)可有效降低“玫瑰香”葡萄的采后腐爛率，與對照相比，果梗腐爛率降低69.6%，果肉腐爛指數降低63.9%。Zahavi等［19］的研究表明，假絲酵母(Candida guilliermondii)對由灰葡萄孢霉引起的葡萄腐爛具有明顯的抑制作用，與對照相比，漿果腐爛可減少16%。據報道［20］，在0℃儲存50 d后，葡萄有孢漢遜酵母(Hansienaspora uvarum)可顯著(p＜0.05)降低灰霉病引起的葡萄腐爛率，使自然腐敗從55%降低到15%。此外，如芽孢桿菌對冷藏條件下的“巨峰”葡萄的采后腐爛率有很好的降低作用，與對照組相比，在貯藏60 d后可使葡萄的腐爛率降低60.2%。產氣霉菌是一種通過產生揮發性化合物而起到防治灰霉病作用的真菌，經人工接種的葡萄串置于透氣性好的聚乙烯包裝袋中，在0.5℃的條件下進行貯藏，當接種劑量分別為5和10 g/kg時，發病率可分別減小到5%和4%，而未經接種處理的葡萄漿果的發病率為43%［21］。但是，目前生物防治劑使用最大的瓶頸有兩個方面，一是登記注冊費用和復雜程度與化學殺菌劑的使用幾乎相當，二是生物防治劑的抑菌譜窄，效果緩慢。因此，雖然許多微生物被證實對葡萄灰霉病具有拮抗作用，但國內外的這些拮抗菌大多僅僅停留在實驗室研究階段，沒有實現真正的商業化［22］。

以上分別介紹了幾種單獨用于葡萄采后灰霉病的生物控制抑菌方法，雖然每一種方法都可一定程度地抑制不同品種葡萄的采后灰霉病的發生發展，但是相比化學類抗真菌劑的抑菌效果來說，兩種或者兩種以上的非化學抑菌劑的組合使用可能更具競爭力。例如Spadaro等［23］的研究發現，在商業方面，單一的拮抗微生物不能提供令人非常滿意的采后灰霉病抑菌效果，為了達到較為理想的采后灰霉病抑制效果，一些科研人員嘗試將一些環境友好的、無害的化合物與生物拮抗劑組合使用，通過協同作用來控制采后灰霉病的發?。?4］。Qin 等［25］報道了采用漢森氏酵母菌結合水楊酸和碳酸氫鈉對葡萄進行采后處理，并在25℃，相對濕度90%～95%的條件下進行貯藏，相對于單獨使用漢森氏酵母菌，漢森氏酵母菌和水楊酸、碳酸氫鈉的結合使用可顯著抑制采后葡萄灰霉病的發病率和病斑直徑。

2.2 天然抗菌劑

2.2.1 鹽類 鹽類包括各種金屬的各類鹽溶液，在果蔬采前和采后通過浸漬或噴灑等手段作用于果蔬表面，通過改變真菌生長的p H，從而達到抑菌目的。Qin等［26］研究了采用0.1%～1%不同濃度的以四硼酸鉀形式存在的硼溶液對鮮食葡萄采后灰霉病的抑制效果，結果表明，在0℃的條件下貯藏30 d后，1%的四硼酸鉀溶液有最好的抑制效果，可使人工接種的單個漿果葡萄的腐爛率從40%降低到2%～3%。Gabler［27］采用自來水作為對照，分別用不同濃度的碳酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸鉀，碳酸氫鉀和碳酸氫銨對分離的葡萄漿果進行處理，研究不同鹽類對不同品種接種漿果的灰霉病發病率的抑制情況，結果表明，對于接種的“來特”漿果葡萄，在15℃條件貯藏7 d后，碳酸氫銨顯示出最好的抑制效果，可使灰霉病的發病率由36.8%降低至2.4%。Konuk等［28］的研究表明，采用藻朊酸鹽對鮮食葡萄進行采后涂膜處理，可以顯著地抑制灰霉病的發生，同時可以保持更高的總酚含量和抗氧化活性。但是，對于采用鹽類溶液進行葡萄采后處理，一個不容忽視的問題就是鹽類在漿果表面的殘留問題，較為理想的效果是表面的殘留溶液在視覺上不可見，否則會影響感官評價結果。

2.2.2 殼聚糖 殼聚糖作為一種天然的可食性保鮮材料，由于其有較好的成膜性、氣體選擇透過性和抗菌性，被廣泛地用做葡萄的采前和采后保鮮包裝處理。Romanazzi等［29］的研究發現，用乙酸溶解的殼聚糖溶液，不管是對15℃貯藏條件下的單個漿果，還是0℃貯藏的整小串葡萄簇，在貯藏60 d后，均對葡萄采后灰霉病具有顯著的抑制效果。Shiri等［30］用0.5%和1%的兩種濃度的殼聚糖對葡萄進行涂膜處理，結果發現，與對照相比，在0℃的條件下貯藏60 d后，0.5%的殼聚糖溶液可使葡萄的腐爛率降低68.6%，而1%的殼聚糖溶液可降低腐爛率65.1%，由此可見，在低溫條件下貯藏，殼聚糖濃度在0.5%～1%范圍內變化時，對葡萄采后由灰霉病引起的腐爛率的抑制沒有形成顯著差異。

2.2.3 蘆薈膠 蘆薈膠作為一種新型的有效的綠色處理劑被廣泛用于多種果蔬的商業涂膜保鮮包裝中［31］，其保鮮效果與其組成有密切的關系［32］。蘆薈膠富含多種生物活性物質，如維生素、酶類、礦物質、木質素、皂苷、水楊酸及酸胺。采用Serrano的專利配方組成，不論是采前還是采后處理，蘆薈膠對鮮食葡萄的灰霉菌有顯著的抑制效果［33］。Farahi等［34］研究發現不同體積比的蘆薈膠對葡萄采后霉變有不同程度的抑制作用，其中體積比為2∶1的蘆薈膠處理組可顯著降低葡萄采后灰霉病的發病率，同時也可減少葡萄的失重率和保持較好的感官品質。葡萄串在采摘前1 d用蘆薈膠溶液進行噴灑處理，然后在2℃下貯藏35 d時，葡萄漿果的爛果率僅為1%，顯著低于對照組的15%。

2.2.4 植物生長調節劑 植物生長調節劑是一類與植物激素具有相似生理和生物學效應的物質，包括人工合成的具有與天然植物激素相似作用的化合物和從生物中提取的天然植物激素，通常主要用來調整植株生長、促進坐果和促使果實膨大。但是，一般使用植物生長調節劑后都會不同程度地降低葡萄的抗病性，并且如果反復多次使用，有可能會使灰霉病對經調節劑處理后的葡萄結構產生一定的敏感性。例如，當Zoffoli對“湯姆森無籽”葡萄兩次使用赤霉酸后，葡萄灰霉病的發病率為1%，但是8次使用赤霉酸并加大使用劑量時，灰霉病的發病率將會增加到12%，其主要原因是葡萄漿果對多次使用的植物調節劑赤霉酸產生了敏感性，使葡萄產生不同程度的落粒和裂果，主要表現為漿果表面的微小細裂紋以及漿果的分裂，另外還會使果粒膨大，果梗變粗變硬，從而增加灰霉病害的發病幾率［35］。

2.2.5 植物提取物 植物提取物是以植物為原料，根據最終提取物的用途，經過物理化學提取分離過程，定向獲取和濃集植物中的某一種或多種有效成分，而不改變其有效成分結構而形成的產品。按照提取植物的成分不同，形成甙、酸、多酚、多糖、萜類、黃酮、生物堿等;按照性狀不同，可分為植物油、浸膏、粉、晶狀體等。

關于采用植物提取物來抑制葡萄采后灰霉病的相關研究有很多報道，其中主要集中在各種植物香辛料和中草藥研究上。Xu等［36］的研究發現，采后鮮食葡萄簇采用葡萄柚籽提取物溶液浸泡處理后，以未經任何處理組為對照，在0℃下貯藏4周后，葡萄漿果感染率為6粒/kg，而對照組為19粒/kg，當人工接種灰霉菌后，采用葡萄柚籽提取物處理組的漿果腐爛率為18粒/kg，而對照組增加到65粒/kg。對于人為傷害并接種灰霉菌的單個漿果來說，通常用開始出現灰霉病癥狀的時間來評價處理組的抑菌效果。利用這種方法，Tripathi等［37］的研究發現，采用羅勒油、桃李屬和生姜三種不同的香精油進行處理后，葡萄漿果開始出現灰霉病癥狀的時間分別為8、9和10 d，而對照組在4 d就開始出現灰霉癥狀。Valero分別采用丁香酚和百里香酚精油對葡萄簇進行浸泡處理，然后在1℃下貯藏56 d后發現，漿果的腐爛率較空白組的50%分別降低了80%和56%［37］。香芹酚對灰霉菌也有一定的抑制作用，Martínez等［38］研究發現0.05、0.2、0.5、1.0 mL/L四種不同濃度的香芹酚蒸汽均可完全抑制灰霉菌在馬鈴薯瓊脂培養基上的生長繁殖，且對單個葡萄漿果進行貯藏發現，當采用最高濃度1.0 mL/L的香芹酚蒸汽處理后，在25℃下貯藏4 d，可使漿果的腐爛率由空白組的93%降低到6%。Melgarejo等［39］采用三種不同形式、不同濃度的肉桂葉油研究其對采后葡萄漿果灰霉菌的抑菌效果，研究發現，經肉桂葉油乳液形式浸泡處理(濃度為5 g·L－1)，可顯著降低葡萄漿果的腐爛率;采用肉桂葉油蒸汽噴灑處理較乳液浸泡處理有更好的抑制效果，所有試驗濃度均可顯著抑制葡萄漿果的腐爛;而如果采用涂膜處理方式，則在貯藏15 d后，葡萄漿果的腐爛率為0。由此可見，肉桂葉油采用蒸汽或涂膜這兩種處理方式可顯著抑制由灰霉菌引起的采后葡萄漿果的腐爛。Gatto等［40］通過對不同草本植物提取物的活性進行體外和體內試驗發現，小地榆(Sanguisorba minor)提取液處理對灰霉菌顯示出最好的抑制效果，其次是園齒木荷提取液;另外，采用花葉滇苦菜(Sonchus asper)提取物對紅提葡萄進行采后處理，相對于空白組，可使葡萄漿果灰霉病的發病率降低42.6%。呂明珠等［41］采用0.1%、0.5%、1%三種不同濃度的肉桂精油保鮮液對紅提葡萄進行噴灑處理后置于不同的溫濕度條件下進行貯藏發現，肉桂精油保鮮液的抑菌作用在2℃低溫、90%RH的高濕條件下發揮更充分，經體積分數為1.0%的肉桂精油處理可顯著降低紅提葡萄的爛果率，具有較好的抑菌效果。

3 展望

由葡萄孢屬引起的灰霉病是葡萄貯運過程中最致命的病害之一，由于其具有腐生性強、寄主范圍廣、潛伏期長等特點，因此，采用化學殺真菌劑和SO2類保鮮劑進行防腐保鮮，是目前采后灰霉病防治的主要途徑。然而，隨著有機葡萄產業的蓬勃發展和消費者對化學殺菌劑在水果表面殘留問題的廣泛關注，高效、安全、環保的新型SO2替代型保鮮劑的研究與開發成為葡萄采后灰霉病抑制的主要研究方向。生物防治技術作為一種新型的用于葡萄灰霉病控制的無公害防治技術，由于存在試驗菌株有限、試驗場所單一(實驗室或田間)，抗菌效果不穩定和成本較高等缺陷，因此，很大程度上限制了其在葡萄采后商業化方面的大量應用。今后的研究方向應著力于對現有的生物防治劑進行改良處理，篩選種類更多的菌株，并通過建立影響生物活性基因的菌株庫，采取導入基因的方法來延長生物防治劑的活性，進而提高灰霉病的抗菌效果。

對于非化學抑菌劑，通常是一些天然抗菌劑，抑菌效果有限，并且大多數的非化學抑菌劑的研究僅停留在實驗研究階段，因此要實現SO2替代型保鮮劑的廣泛使用，應從以下三個方面努力:一是在使用手段上，將非化學抑菌劑的采前預處理作為葡萄采后抑菌的主要手段，同時加快開發更加有效穩定的抑菌劑的研究進程，著力于天然保鮮劑的組合或復配工藝的研究和使用，并通過進行大規模的活體抑菌實驗，逐步擴大其實際商業化應用范圍，提高針對性和適用性;二是提高消費者和零售商的無農藥殘留意識，并加大有機葡萄產業的監管力度，逐步減少或禁止SO2類化學保鮮劑的使用;三是逐步提高社會對SO2替代型保鮮劑商業化應用的接受程度。

SO2替代型保鮮技術專業在我國才剛剛起步，然而，隨著非化學抑菌劑對葡萄體外和活體內研究的不斷深入，葡萄采后灰霉病防治技術將日臻完善，發展潛力巨大，有望最終取代傳統的SO2抑菌技術。