乳清蛋白水解物的研究進展及應用

孫景珠，趙麗雙，劉麗波，李 春，*

(1.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東泰安271000;2.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030)

乳清是在生產干酪及干酪素過程中，除去酪蛋白沉淀后所得的物質，具有很高的營養價值。乳清直接烘干所得的乳清粉中，乳清蛋白所占含量一般為百分之十幾，不超過百分之三十［1］。乳清蛋白是一種優質蛋白，常被用作人體優質蛋白補充劑，素有“蛋白質之王”之稱，它不僅易被消化吸收，而且還含有多種活性成分［2］。乳清蛋白的許多功能性質，如成膠性、持水性、攪打起泡性、乳化性、涂層性、微膠束化等在食品中均有廣泛的應用［3］。乳清蛋白雖有很多優點，但由于它是大分子蛋白，在腸道中需經水解成短肽和游離氨基酸后方可被吸收，且對熱、酸敏感，易變性，變性后溶解度降低，限制了它在食品中的應用［4－5］。而乳清蛋白水解物則是乳清蛋白經水解后得到的產物，其大部分構成成分是小肽及氨基酸，改善了乳清蛋白對熱酸的敏感性。大多數學者研究表明，乳清蛋白經水解后還會釋放出一些具有特定活性的氨基酸序列，即活性肽，它們具有特殊的生理功能［6］。隨著對乳清蛋白水解物研究的不斷深入，它在食品中的應用也越來越多樣化。因此，本文系統地概述了乳清蛋白水解物的制備，生物活性，并對乳清蛋白水解物在食品領域的應用進行了論述，以利于乳清蛋白水解物的進一步開發與應用。

1 乳清蛋白水解物的制備

1.1 化學水解法

化學法包含酸水解和堿水解。酸水解通常利用HCl溶液作為水解劑，該水解反應劇烈，谷氨酰胺和天冬酰胺被完全水解，絲氨酸只有部分被水解，而色氨酸則被完全破壞;堿水解一般用KOH溶液、NaOH溶液，這種水解法會破壞氨基酸產生氨氣，且易變旋［7］。

化學法雖水解較完全，但反應劇烈，對氨基酸破壞性大，重復性差，產物雜，且不易控制水解度，通常不采用此種方法。

1.2 酶解法

酶解法是采用特定蛋白酶在最適溫度和pH下對乳清蛋白進行的酶解反應，它反應條件溫和，反應特異性強，且制酶工藝不斷成熟，蛋白酶資源豐富，成本低，故酶解法是最常用的一種水解方法［8］。酶解法所得到的產物是肽段，不會破壞氨基酸的結構，營養價值更高，更易被人體吸收。

酶解法產生的肽段具有許多的生物功能，目標功能不同，所選擇的蛋白酶種類，酶解條件及水解度均不同。石丹等［9］以低致敏性為指標，采用堿性蛋白酶，研究了乳清蛋白水解的工藝條件，發現在酶解溫度60℃，pH9.0，加酶量19000 U/100 mL，酶解時間4 h時，抗原殘留量最低，為原料的5%，此時水解液的水解度為16.0%。鐘興業［10］利用自制的固定化中性蛋白酶進行水牛乳抗氧化活性肽的研究，在最適條件，溫度55℃，p H7.5，加酶量2000 U/g，酶解5 h時，水解產物的DPPH自由基清除率可達到65.24%。

酶的種類對酶解效果及最終產物都有較大影響，常用的酶的種類有木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等。由于每一種酶都有特定的酶切位點，不同酶作用乳清蛋白，所得酶解產物及水解度均不一致。復合酶水解法即是利用這一特點，利用兩種及兩種以上蛋白酶同時作用在乳清蛋白上，對其進行限制性水解。這種水解方式不僅使蛋白水解率得以提高，而且還賦予所得肽段更多生理功能［11］。Lakshman 等［12］以胰蛋白酶、胃蛋白酶和從紅曲霉中提取的兩種酸性蛋白質Mpi AP1，Mpi AP2為水解用酶，對乳清蛋白分別進行了單一酶解和復合酶解，研究發現，復合酶解更利于乳清蛋白水解，能更大程度提高乳清蛋白酶解物的水解度。Wang［13］等利用堿性蛋白酶－中性蛋白酶對乳清蛋白進行酶解，結果表明，水解產物與單一酶解相比，血管緊張素轉換酶(angiotensin convert enzyme，ACE)抑制能力最高，產物的灰分含量最低。

隨著研究的深入，一些新型的酶解方法逐漸進入人們視野，超高壓水解乳清蛋白和微波輔助酶解乳清蛋白是兩種較常用的物理輔助酶解法［14］。這兩種酶解法在傳統酶解基礎上，整合超高壓和微波技術，極大的提高了酶解反應速率，縮短了反應時長，并且改善了產物特性，增加了多肽和氨基酸的產率，降低了能耗，是一種高速高產節能環保的酶解方法。

1.3 微生物發酵法

微生物發酵法與酶解法類似，都是利用蛋白酶對乳清蛋白進行水解，但與酶解法不同的是，蛋白酶來自微生物發酵過程。微生物發酵法可達到較高的水解度，故適用于低聚肽的生產，可降低成本，并且微生物中所含有的肽酶，可以消除苦味肽，賦予產品良好風味。

乳酸菌是微生物發酵過程中的常用菌種，生長過程中需要多肽和氨基酸作為營養物質，生長后會分泌蛋白酶將環境中的蛋白質水解。郭宇星［15］對微生物發酵法水解乳清粉制備生物活性肽進行了研究，以瑞士乳桿菌TS2005為發酵菌株，以發酵液為原料生產ACE抑制肽，并確定最佳發酵條件及工藝路線。Li等［16］同樣利用微生物法，采用克魯維酵母菌Z17發酵牛乳，從而獲得ACE抑制活性肽，并利用響應面法得出發酵溫度是影響多肽生物活性的一個重要因素。

1.4 亞臨界水水解法

亞臨界水是指水的狀態處于沸點以上，臨界點以下的液態，這個狀態需要加熱和加壓維持，這種狀態的水也叫高壓熱水、高溫水和過熱水［17］。這種水解方法是以水為介質，在高溫高壓下水分子會裂解使得離解常數增大，促進乳清蛋白水解，效果等同于雙催化劑水解或者酸堿水解，是一種很有效的水解方法。

研究發現［1，18，21，38］，這種水解方法有如下優點:水解效率高，價格便宜，無需使用水解酶及有害試劑，安全可靠。但其水解時間和溫度會影響其水解度，可通過控制這些因素來控制產物品質。

2 乳清蛋白水解物的生物活性

2.1 低致敏性

由于牛乳和母乳中蛋白結構有較大差異，母乳中乳清蛋白約為70%，而牛乳中乳清蛋白含量僅為21.5%［1］，故生產嬰幼兒配方粉時經常添加脫鹽乳清粉以作調整。乳清蛋白雖然營養價值高，但其中含有的α－乳白蛋白和β－乳球蛋白具有致敏性，嬰兒食用后會出現不用程度的致敏癥狀，輕者會引起鼻炎、腹瀉、濕疹，重者則會引起胃腸出血［19］。乳清蛋白經蛋白酶水解后，其部分抗原決定片段也會隨之被水解，從而降低其致敏性。用乳清蛋白水解物替代乳清蛋白是目前最常用的降低致敏性的方法。

試驗發現［20］，經過篩選以中性蛋白酶為最佳水解用酶，水解度與β－乳球蛋白致敏性降低率不成正比關系，在溫度為45℃，pH為7，E/S為2500 U/g，水解3 h時，致敏率降低最大，且水解后，持水性增強;Kim等［21］發現與用胰蛋白酶和胃蛋白酶單純酶解濃縮乳清蛋白相比，用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同水解經熱處理后的濃縮乳清蛋白，水解度更高，過敏原性降低更顯著。

2.2 抗氧化性

抗氧化肽是一種從自然界生物中提取、化學合成或是通過降解蛋白質所得到的一種活性成分，它通常是作為供電子體或供氫體，或與金屬離子鰲和來促進過氧化物分解和清除自由基，從而起到抗氧化作用［6］。人類的許多疾病如肥胖、心肌梗死、動脈硬化等都與自由基的氧化作用有關，適度攝入抗氧化肽有利于疾病的預防，還可以延緩衰老。乳清蛋白經酶解后的酶解液中也含有這種物質。抗氧化肽一般是從自然界中獲取或是化學合成，但由于自然生物體中抗氧化成分含量低，有機溶劑殘留多，提取成本高，而化學合成工藝價格高，產率低，安全性差，故這兩種方法均不適合大量生產，蛋白質降解成為一個更有效的生產抗氧化肽的途徑。

吳慧［22］以Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶為最適酶，研究乳清蛋白抗氧化肽構效關系，酶解物經分離純化得到八種抗氧化活性不同的肽段，分別是Arg－Val－Tyr、Ala－His－Leu－Trp、Gly－Thr－Ser－Val、Val－Phe、Try－Ser－Leu、Leu－Phe、Trp－Tyr－Ser－Leu、Val－Ala－ Gly－Thr－Ser－Val－Tyr，其中 Trp－Tyr－Ser－Leu自由基清除率最高，為87.90%(500μmol/L)。彭新顏等［23］通過研究水解物對硫代巴比妥酸值(TBARS)和過氧化值(PV)的抑制作用以及DPPH自由基清除能力等的分析，得出在底物濃度為5%時，添加2%的蛋白酶，水解5 h時抗氧化活性最強。

2.3 促乳酸菌增殖

對于蛋白肽促生長的研究，最初以大豆蛋白肽促乳酸菌增長的研究居多，直到近幾年，隨著對乳清蛋白水解物研究的深入，人們對乳清蛋白水解物可促乳酸菌增殖越來越認可。蛋白水解物能促進乳酸菌增殖是因為在乳酸菌生長過程中，相比于氨基酸，它們更喜歡利用短肽，故而富含短肽的蛋白水解物更利于乳酸菌生長［24］。乳酸菌雖然自身也產生蛋白酶，但其水解能力較弱，有研究發現乳清蛋白水解物促進效果優于大豆蛋白水解物［25］。

不同分子量大小的肽段對乳酸菌增殖作用不同，韋慧娟［26］研究發現酶解產物中分子量小于3 k Da肽段促干酪乳桿菌生長效果最好，還發現加入水解物的多少對其生長也有影響，當乳清蛋白水解物替代量為40%時，促生長作用最顯著。高海燕［27］研究乳清蛋白水解物在培養基中的應用，將水解物以8 g/L的量替代MRS培養基中的蛋白胨，促生長效果較好;替代酵母粉，則不利于保加利亞乳桿菌的生長;雙替代則接近或優于自配或市售MRS培養基，對嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌培養效果最好;全替代氮源不利于保加利亞桿菌生長，其他菌種生長較好。

2.4 降膽固醇

目前有研究表明，許多蛋白酶解物所含的活性肽都能降低動物的血清膽固醇水平，對一些疾病如動脈粥樣硬化，有一定的預防作用，其中由以酪蛋白和大豆蛋白研究較多，而對乳清蛋白研究較少。但這并不代表乳清蛋白水解物不具有降膽固醇能力，Nagaoka［28］從β－乳球蛋白的胰蛋白酶解液中分離出一種較為專一有效的降解膽固醇的生物活性肽，它的氨基酸序列是 Ile－Ile－Ala－Glu－Lys，這種肽的活性比當時一種降膽固醇的藥物(β－谷甾醇)還要強。為了做進一步研究，高學飛［29］利用 CM－Sephadex C50為層析材料對酶解液進行篩選，得到目標活性肽，確定分子量大小為1～12 k Da，并進行動物實驗，得出這種活性肽還具有降低血液中膽固醇、甘油三酯水平，減小動脈硬化指數，促生長及降低脂肪沉積的生物活性。現階段，對于乳清蛋白源活性肽降膽固醇的機理仍不確定，降膽固醇肽仍有較大的研究空間。

2.5 降血壓

高血壓是現代人們常患的“三高”病之一，嚴重影響人們健康。傳統的降壓藥大部分都是化學合成的，常期服用對人體的腎臟及尿酸代謝、脂肪代謝和糖代謝產生一定影響，停藥后還會引起一系列綜合癥，所以對安全可靠的降壓產品的需求越來越迫切。最初的天然抗氧化肽是從毒蛇中提取，而后發現乳清蛋白、大豆、玉米蛋白、大蒜、魚肉都可以提取出降血壓活性成分，乳清蛋白源的降壓肽來自牛乳，是一種天然的降壓活性分子［30］。

ACE是廣泛存在各種組織中的膜結合蛋白，它對血壓調節有一定作用。乳清蛋白水解物可以抑制ACE活性，從而起到降血壓作用。于曉慶等［31］研究酶法制備乳源ACE抑制肽，確定在3%的用酶量、溫度52℃、pH為7、底物濃度為4.5%，水解9.5 h時，制備效果最好，半抑制濃度(IC50值)為1.2063 mg/mL。為了驗證抗氧化肽在體內的功效，徐思源［32］利用原發性高血壓鼠進行動物實驗，結果表明，在進食4 h后ACE活性最低，隨后緩慢增加到近似原有血壓水平，這說明乳清蛋白水解物降血壓效果較穩定。

2.6 降血糖

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，也是富貴病中的一種，分為1型和2型糖尿病，表現癥狀為高血糖，2型糖尿病有較大的遺傳特性，嚴重影響人們生活［33－34］。目前，有研究表明，食源性的降血糖活性成分可從菜籽、牡蠣、雜色蛤、蠶蛹、楊梅等中提取，但對乳源的降血糖成分的研究并不是很多［35－37］。徐慶等［38］在這方面進行了研究，他們用水解度為14.8%的乳清蛋白酶解物喂食KKAy小鼠，結果表明小鼠血糖有所降低，并且灌胃半小時后的胰島素水平明顯提高。

2.7 促進礦物質吸收

乳清蛋白水解物中能與礦物質元素鰲合，并進一步促進礦物質吸收的物質稱為促礦物質吸收肽，它的中心位置有谷氨酰殘基和磷酸化的絲氨酸基團，能與金屬離子例如鈣、鐵、鋅結合，待機體需要時，會緩慢釋放出金屬離子，以供機體所需［39］。近年來，對促鈣離子吸收的乳清蛋白源肽研究較多。肖姍［40］對乳清蛋白鰲合肽進行研究，發現肽鈣質量比，溫度，溶液pH都會影響鈣離子鰲合率，當肽鈣質量比為1∶5，多肽溶液初始 p H為10.5，65℃下反應50 min時，效果最佳，此時鰲合率為7.45%。郭麗麗等［41］研究發現，乳清蛋白酶解可制備促鈣離子吸收肽，當水解液中氨基氮含量為0.272 mg/mL時，產生的肽具有最強的體外持鈣活性。

2.8 其他特性

乳清蛋白水解物除具有以上功能特性外，還具有提高記憶力、抗菌、抗腫瘤、免疫調節等作用［42］。卞輯［8］為研究乳清蛋白水解物的提高記憶力，抗衰老等功效，對灌食乳清蛋白肽的衰老小鼠進行行為學研究，結果發現，衰老小鼠在跳臺、暗箱中躲避電擊以及水迷宮定位航行實驗中，都較對照組有更好的表現，這說明乳清蛋白水解物對小鼠有提高記憶功效;柯德森等［43］在研究乳清蛋白水解程度與抗菌能力的關系時，水解程度小于12 mg氨基酸/mL時呈正相關，水解程度大于12 mg/mL時呈負相關，在10～12 mg/mL時抗菌能力最強。對于乳清蛋白水解物抗腫瘤、免疫調節作用研究的不多，需進一步探索。

3 乳清蛋白水解物在食品中的應用

3.1 在飲料中的應用

我國飲料產品除碳酸飲料、果蔬飲料及功能性飲料外，蛋白飲料逐漸成為人們關注的熱點［44］。乳清蛋白水解物中含有多種活性肽，易吸收且對人體有諸多益處;而飲料銷量大，食用方便，可接受性強，故而乳清蛋白水解物的應用較為廣泛。馬平［45］將乳清蛋白肽與營養豐富的人參提取液結合起來，研制出一款人參乳清蛋白多肽飲料，長期服用有諸多好處，不僅能提高免疫力，還能延緩衰老，降血糖。隨后乳清多肽茶飲料、菠蘿乳清多肽飲料、乳清多肽果汁飲料也應運而生［46－48］。

由于乳清蛋白經水解后會有苦味肽產生，口味差，如何去除苦味肽也是一項重要的研究內容。何光華［49］在研究蛋白苦味肽修飾時發現，通過轉換蛋白酶不能解決苦味肽的問題，但是將乳清發酵的水解液與發酵液按1∶1配比，所得到的飲料沒有苦味，且色澤呈乳白色。

3.2 在乳制品中的應用

3.2.1 在酸奶中的應用 在酸乳生產過程中，使用直投式發酵劑的比例逐漸增大，由于近年來，人們更加注重養生，而酸乳營養豐富，故其銷售量逐年增加。酸奶的發酵時間一般是在4～6 h，如何縮短酸乳發酵時間，降低生產成本，是近年來的一個研究熱點。乳清蛋白水解物由于其蛋白分子量小，多為小肽和氨基酸，更易被乳酸菌利用，故而可以用于酸奶生產中［50］。曲杜娟［51］以同種酶不同水解度和不同酶同一水解度的乳清蛋白水解物等量替代奶粉用于酸奶發酵，結果表明，用Flavourzyme和Alcalase堿性蛋白酶水解，添加3%的水解物可縮短發酵時間12%左右，小于3 kDa的組分更易促酸奶發酵，并且儲藏31 d后，其表觀粘度增加6.5%，且與空白相比，酸化程度較低。乳清蛋白水解物可以促乳酸生長，故也可用于酸奶發酵劑的改良。白鳳翎［52］研究發現，蛋白水解物對嗜熱鏈球菌促生長效果要好于保加利亞乳桿菌，添加酵母膏，菌數可增長1.0～1.5個數量級。可見乳清蛋白水解物對酸奶發酵劑產業也有一定的推動作用。

3.2.2 在嬰兒配方奶粉中的應用 嬰兒配方奶粉中需要添加乳清蛋白以調節乳清蛋白與酪蛋白的比例，以適合嬰兒所需。乳清蛋白中的α－乳白蛋白和β－乳球蛋白，因其具有過敏表位，而成為牛乳中的主要過敏原。將乳清蛋白水解后添加，可以降低致敏性。不同水解度有不同功效，完全水解配方粉，也就是氨基酸配方奶粉，用于重度牛奶蛋白過敏嬰兒，主要產品有雀巢恩敏舒、美國紐康特;深度水解配方粉適用于中輕度牛乳蛋白過敏嬰兒或是重度六個月轉輕度，產品主要有澳洲愛他美、荷蘭紐太特、荷蘭牛欄;部分水解配方粉用于預防過敏反應的發生，主要產品有雀巢超級能恩，美贊臣親舒。低敏奶粉水解度越高，味道喪失越多，口感越差。有研究表明［53］，完全水解的牛乳蛋白配方粉中含有大量游離氨基酸，95%以上肽段分子質量應低于3 kDa;深度水解的配方粉中含有80%～85%的短肽及游離氨基酸，肽段分子質量位于3～10 k Da之間;部分水解的配方粉中含有多肽，分子質量相對于深度水解較大，但大部分仍處于3～10 k Da之間。趙紅霞［54］用水解蛋白部分替代原有蛋白質，制成一種低敏性嬰兒配方粉，然后對它的感官性質及營養成分進行分析，發現與原配方粉并無異常，但卻具有低致敏性。

3.2.3 在干酪中的應用 干酪是以鮮乳為原料，加入發酵劑與凝乳酶，蛋白質凝固后排乳清，經成熟后得到的發酵制品，含有多種維生素及礦物質。它的成熟期很長，以切達干酪為例，大約是6～12個月，成熟成本高。一般用物理、化學、生物方法使蛋白質和脂肪降解成易被乳酸菌利用的小分子，從而加速發酵，縮短時長。曹巖［55］研究了乳清肽對快速成熟干酪質量特性影響，乳清蛋白肽通過促進乳酸菌增殖，從而促進干酪成熟，研究發現，當水解至乳清肽的分子量為3 k Da，添加量為2%時，促成熟效果最好，檢測各項指標，均達到成熟標準。

3.3 在肉制品中的應用

早在多年前，就有研究表明，乳清蛋白可以被用在肉制品生產中，主要是為了提高肉制品中蛋白質含量，增加肉的持水性，改善肉的切片性［56］。同樣，乳清蛋白水解物也可以用于肉制品加工中，這主要是利用乳清蛋白水解物的抗氧化性。許柳［6］研究了乳清蛋白酶解物在冷卻鴨肉保鮮中的應用，他發現，乳清蛋白水解物的抗氧化性在低溫和酸性條件下發揮的更好，將其用于冷卻鴨肉保鮮中，能明顯的抑制脂肪氧化，添加10%的酶解液，保鮮效果最好。同樣的，彭新顏［57］發現，乳清蛋白水解物同樣適用于熟肉糜的保鮮中，添加2%的水解物的肉糜在貯藏中不僅紅度值(a*)較對照組高，而且其抗氧化效果與添加0.02%的丁羥基茴香醚(butyl hydroxyl anisd，BHA)相當。

4 結論與展望

食源性蛋白肽是最近研究的一個熱點，乳清蛋白水解物含有的多種活性肽也逐漸被發現和利用，這大大提高干酪副產物乳清的附加值。乳清蛋白水解物的制備方法已較為完善，一些高新技術正在逐步取代傳統的制備方法。對于水解物的生物活性來說，其低致敏性、抗氧化性、促乳酸菌增殖這幾方面研究較多，而對降血糖、降膽固醇、提高記憶力等方面研究較少，一些活性肽的作用機理尚未完善，有較大的研究空間。乳清蛋白水解物應用在飲料、乳制品、肉制品中較多，而在食品的其他方面，如焙烤食品、休閑食品、冷凍食品等卻尚未開發。有研究表明［42］，乳清蛋白水解物可以用于保健食品的開發，雖有理論依據，但卻無實際產品，日本對乳清蛋白肽的保健食品開發較多，但國內尚為空白。探討限制乳清蛋白水解物應用的原因，一方面是由于酶解成本較高，另一方面是由于提取技術尚未成熟。相信隨著研究的深入及乳清蛋白活性物質提取工藝的成熟，乳清蛋白水解物的生物活性必會被充分開發與利用，其產品在國內市場也必有廣闊空間。