高場強超聲處理對柑橘果膠分子結構及其功能特性的影響

陳倩茜，張萌，王海燕，黃夢玲，劉鳳霞

(華中農業大學 食品科技學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢，430070)

果膠是一類廣泛存在于植物細胞壁的初生壁和細胞中間片層的雜多糖[1]，其結構和化學組成復雜，普遍觀點認為果膠結構分為光滑區和毛發區，光滑區由α-D-半乳糖醛酸殘基通過α-1,4糖苷鍵聚合而成，毛發區由高度分支的α-L-鼠李半乳糖醛酸聚糖組成[2-4]。有研究表明不同來源的果膠具有不同的半乳糖醛酸含量、蛋白含量、總糖含量和分子質量，其中分子質量的差別最大[5]。果膠作為天然的大分子多糖，具有優良的增稠、凝膠、穩定和功能特性，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、紡織、煙草等行業[6-11]。但天然果膠由于分子質量較大且不同來源果膠結構上的巨大差異而限制了其在食品及醫藥工業中的應用[12]，為全面滿足需求，通常采用化學、生物和物理的改性方法來降低果膠分子質量、改變其甲酯基含量及分布、添加基團對果膠結構進行修飾等[13-15]。其中分子質量是果膠的一項重要指標，大分子質量的果膠不能被人體吸收，而改性之后的小分子質量果膠可被人體吸收，從而擴大了果膠在食品和醫藥領域的應用范圍[16-17]。柑橘皮是果膠的重要來源，果膠含量占其干重的20%～30%[36]。我國柑橘種植面積和產量均居世界首位，按國內柑橘年產量和加工量推算，每年可產生 200萬t以上的柑橘皮副產物，除極少數用于陳皮等加工外，大部分被直接丟棄掩埋，造成嚴重的資源浪費和環境污染[37]。因此，利用我國豐富的柑橘皮果膠資源做研究可在一定程度上提高柑橘皮利用率。

高場強超聲技術是利用超聲產生的巨大沖擊波破碎細胞，目前已被廣泛用于果膠提取[18-22]。另外，由于超聲處理過程中產生的機械作用、空化作用和熱效應[23-24]，超聲波也被證明是一種生物大分子的有效、綠色地定向降解方法[25]。王博等利用超聲波提取水溶性茯苓多糖，表明超聲波不會對其單糖種類、組成以及單糖結構造成影響，但是對茯苓多糖的分子鏈有顯著影響[26]。SESHADRI等研究了超聲波方法對高甲氧基果膠流變學特性和光學特性影響，結果顯示隨著超聲強度的增強和處理時間的延長，果膠形成凝膠的凝膠力較弱，形成的凝膠更加透明，同時果膠的流變學特性發生了明顯變化，逐步趨向于牛頓流體[27]。然而，上述研究主要集中在超聲處理對果膠分子結構、理化性質及流變特性的研究，超聲處理后果膠乳化特性的變化研究相對較少，超聲處理通過影響果膠分子結構及理化性質，進而影響果膠各類功能特性的研究尚缺乏系統性。

本實驗重點探究不同超聲時間和超聲強度條件下柑橘果膠的理化指標、流變性質和乳化性質的變化，以期明確超聲對果膠多糖的定向降解規律，為后期低分子果膠生物活性的研究及實際生產應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品柑橘果膠，貨號為P9135，購于Sigma- Aldrich上海貿易公司。

四硼酸鈉、半乳糖醛酸、間苯基苯酚、濃H2SO4、NaOH、蒽酮試劑、疊氮化鈉、右旋糖酐、甲醇、NaNO3等均為國產分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；食用級精制大豆油，購于上海嘉里食品工業有限公司。

1.2 儀器與設備

JY92-IIDN超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司生產；JA12002電子天平，龍騰電子公司生產；BT224S分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司生產；PB-10PH計，德國Sartorius集團生產；紫外可見分光光度計UV-762，北京普析通用儀器有限公司生產；流變儀AR2000，美國TA公司生產；激光粒度分析儀，美國貝克曼庫特公司生產；Zeta電位儀，英國馬爾文儀器公司生產；內切式勻漿機，寧波新芝生物科技有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 樣品超聲波處理

采用超聲波處理器模型JY92-2D處理樣品。準確稱取3.00 g柑橘果膠溶于97 mL水中，取25 mL果膠溶液置于頻率20 kHz的超聲場中。超聲作用時間為0、10、20、30和45 min；超聲強度為20%、30%、40%、50%和60%；超聲探頭直徑6 mm；探頭插入液面下2 cm，液面高度4 cm；溫度設置(25±1) ℃；脈沖時間4 s，間歇2 s；單因素實驗中改變超聲時間時強度為50%，改變超聲強度時時間為10 min。試驗過程中采用冰浴控溫，溫度由超聲波儀自帶的溫度探頭測定。為減小每次的操作誤差，處理完的樣品迅速置于4 ℃條件下冷藏并于24 h內測定相關性質。

1.3.2 半乳糖醛酸含量測定

果膠半乳糖醛酸含量的測定依據參考文獻[28]，略作修改。取果膠溶液1 mL，加入6 mL 0.012 5 mol/L的濃硫酸-四硼酸鈉溶液，立即放入冰水浴中。振蕩混合均勻后于沸水浴中5 min，并再次放入冰水浴中冷卻至室溫后加入0.1 mL的0.15%間苯基苯酚溶液，振蕩后，放置15 min后用分光光度計在520 nm處測定其吸光值，空白加入的反應試劑為蒸餾水。以半乳糖醛酸標品制備標準曲線，得到吸光度值Y與果膠半乳糖醛酸含量X關系的標準曲線為Y=99.052X+4.584 5，R2=0.993。果膠半乳糖醛酸含量按如下公式計算：

(1)

式中：Y,從標準曲線中查得的半乳糖醛酸質量濃度，μg/mL；N,稀釋倍數；m，溶解的果膠樣品重量,μg。

1.3.3 總糖含量測定

果膠總糖含量的測定依據參考文獻[29]，略作修改。精確量取80 μg/mL的果膠樣品1 mL，加入4 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4中，現配現用)，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，煮沸10 min。用冰浴冷卻至室溫后在620 nm處測其吸光值，空白以1 mL蒸餾水代替樣品。以葡萄糖為標準品制備標準曲線，得到吸光度值Y與果膠總糖含量X關系的標準曲線為：Y=0.006 86X+0.009 45，R2=0.995，根據標準曲線當量計算出果膠中的總糖含量。

1.3.4 蛋白質含量測定

將3%果膠溶液用蒸餾水稀釋至80 μg/mL，按照Lowry試劑盒的操作步驟測定其吸光值，空白以1 mL蒸餾水代替樣品。使用Lowry試劑盒測定繪制吸光度值Y與蛋白質含量X關系的標準曲線為：Y=2.650 4X-0.024 75，R2=0.994，根據標準曲線當量計算果膠中的蛋白含量。

1.3.5 果膠分子質量分布的測定

果膠分子質量分布的測定采用十八角度激光散射儀進行。流動相為0.05 mol/L NaNO3(含0.02%疊氮化鈉)，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 mL。采用20%甲醇做歸一化處理，以右旋糖酐為標品，測定樣品果膠的分子質量分布。

1.3.6 果膠溶液粒徑和電勢測定

果膠溶液粒徑和電勢的測定依據參考文獻[30]，略作修改。將果膠溶液稀釋至質量濃度1 g/L，使用馬爾文激光粒度儀Size模式，在25 ℃下測定不同果膠溶液的粒徑分布情況。調節果膠溶液pH值分別為3、4、5、6、7，使用馬爾文激光粒度儀Zeta potential模式，在25 ℃測定其不同pH下的電位。

1.3.7 果膠溶液流變性質和表觀黏度測定

果膠溶液流變性質和表觀黏度的測定依據參考文獻[30]，略作修改。果膠溶液的流變性質和表觀黏度測定采用空氣軸承旋轉流變儀AR2000進行。選用40 mm的2°錐板，溫度使用恒溫水循環系統控制在25 ℃，果膠濃度3%(質量分數)，樣品放置時剛好覆蓋轉子邊緣。剪切速率0.01～100 s-1，溫度25 ℃，記錄檢測樣品的粘度隨剪切速率的變化。

應變掃描：固定頻率1 Hz，溫度25 ℃，在0.01%～100%進行應變掃描以確定線性黏彈區(LVR)，由實驗結果可知，為保證測定過程中所有果膠樣品均在線性黏彈區內，選擇1%作為應變掃描值進行0.1～10 Hz頻率掃描，溫度25 ℃，記錄貯藏模量G′和損耗模量G″。

1.3.8 果膠乳化性質的測定

果膠乳化性質的測定依據參考文獻[31]，略作修改。果膠乳化性主要從乳液粒度和乳液穩定性兩方面進行表征。濃度為1%(質量分數)的果膠溶液20 g中加入15 g精制大豆油于50 mL離心管中，10 000 r/min均質3 min(1 min/次)制備果膠乳化液。乳液粒度測定采用馬爾文激光粒度儀進行，測量背景為水，逐步滴加樣品使遮光度在75%左右進行測量，每個樣品自動重復測定3次。果膠乳液穩定性測定采用儲藏期法進行，乳液水平放置在4 ℃冰箱中并加入0.02%疊氮鈉防腐，觀察乳液穩定情況。

1.3.9 數據處理

所有試驗重復3次，以平均值±標準差的形式表示。采用Origin 8.5軟件對數據進行方差分析(ANOVA)和T檢驗并制圖，顯著性水平0.05。

2 結果與分析

2.1 高場強超聲處理對果膠理化指標的影響

2.1.1 果膠溶液半乳糖醛酸、蛋白質及總糖含量

不同處理果膠的半乳糖醛酸、蛋白質及總糖含量如表1和表2所示。由表1和表2結果可知，超聲處理后果膠的半乳糖醛酸、蛋白質和總糖含量并未發生顯著性變化。

2.1.2 果膠分子質量分布

由圖1可知，超聲波處理時間和強度使柑橘果膠的分子質量有下降趨勢。隨著超聲時間的增加和超聲強度的增強，果膠分子質量分布趨于向小分子質量果膠移動，這可能是由于超聲處理過程中產生的空化效應引起果膠分子鏈的斷裂[25-26]。

A-超聲時間; B-超聲強度圖1 不同超聲時間和強度對柑橘果膠分子質量分布的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time and intensity on molecular weight of citrus pectin

由果膠平均分子質量變化結果可知(表1、表2)，超聲時間較短或超聲強度較低時，果膠平均分子質量降低速率較大，而隨著時間的延長和強度的增大，果膠平均分子質量降低速率減小。如前所述，超聲引起果膠降解主要是由于空化效應，但這種效應對果膠分子質量的影響不會隨著處理時間的延長和處理強度的增加而無限制增強，因此超聲處理下果膠的平均分子質量逐漸趨于穩定。另外，超聲處理效果與反應介質的性質及超聲波裝置等都有密切關系[32]。

2.1.3 果膠溶液粒徑

由表1和表2中果膠溶液粒徑數據可知，超聲處理會明顯影響果膠溶液的粒徑，超聲時間越長、超聲強度越大，果膠溶液粒徑越小。一方面，超聲處理會通過打斷果膠的半乳糖醛酸長鏈而減小果膠分子粒徑，這一結果與果膠分子質量變化趨勢相一致；另一方面，超聲處理也可通過影響果膠分子的空間構象而影響果膠溶液的粒徑大小。王苗苗等的研究發現[30]，超聲處理會導致芒果果膠伸展的構象趨于聚集而引起果膠粒徑減小。

2.1.4 果膠溶液Zeta電勢

Zeta電勢可有效地表征大分子如果膠的表面電荷性質和膠體體系的穩定性。表1和表2為果膠溶液在不同pH下的Zeta電勢，由結果可知各果膠在pH 3～7的Zeta電勢均為負值，且呈現出相同的規律。即溶液pH=3時，果膠電勢的絕對值最小，隨著pH的增大，果膠電勢的絕對值也增大，當pH達到6～7時，電勢不再發生明顯變化。超聲處理前后的果膠在相同pH下的電勢并未發生顯著變化，表明超聲處理并未顯著改變果膠溶液表面電荷分布情況。

表1 超聲時間對柑橘果膠平均分子質量、粒徑、Zeta電勢及理化性質的影響Table 1 Effects of ultrasonic time on molecular weight, size, zeta potential and physic-chemical properties of citrus pectin

注：數據為平均值±標準方差。同一行中不同大寫字母標注表示0.05水平上有顯著性差異；同一列中不同小寫字母標注表示在0.05水平上有顯著性差異。

表2 超聲強度對柑橘果膠平均分子質量、粒徑、Zeta電勢及理化性質的影響Table 2 Effects of ultrasonic intensity on molecular weight, size, zeta potential and physic-chemical properties of citrus pectin

注：數據為平均值±標準方差。同一行中不同大寫字母標注表示0.05水平上有顯著性差異；同一列中不同小寫字母標注表示在0.05水平上有顯著性差異。

2.2 高場強超聲處理對果膠溶液表觀粘度變化的影響

由圖2可知，隨剪切速率的增加，果膠呈現剪切變稀的趨勢即假塑性流體的性質，超聲處理后逐漸趨于牛頓流體；且隨著超聲時間的延長和超聲強度的增大，相同剪切速率下果膠溶液的表觀黏度下降。該研究與SESHADRI等的研究結果相一致[27]。果膠的黏度與果膠分子質量和半乳糖醛酸含量密切相關[30]，如前所述，超聲處理后果膠的半乳糖醛酸含量無顯著變化，但果膠平均分子質量顯著減小，這可能是導致果膠表觀黏度下降的主要原因。

A-超聲時間; B-超聲強度圖2 不同超聲時間和強度對果膠表觀黏度的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time and intensity on apparent viscosity of citrus pectin

2.3 高場強超聲處理對果膠溶液黏彈性變化的影響

在應力為1%、頻率掃描范圍為0.1至100 Hz條件下確定超聲處理前后果膠溶液的貯存模量G′和損耗模量G″。G′代表樣品體系的彈性成分，而損耗模量G″代表樣品體系的黏性成分。G′>G″的體系是屬于凝膠體系，而G′G′一直存在，表明果膠一直處于溶膠狀態。隨著不同超聲時間的處理，列出圖3-B和圖3-C，G′與G″出現交點，說明果膠凝膠能力增強，即超聲處理后果膠表現為彈性特性，更易形成凝膠。隨著不同超聲強度的處理，圖3-D和圖3-E中，也出現了G′與G″交點，說明果膠凝膠能力增強。雖然超聲波處理后果膠凝膠能力增強，但交點的變化沒有顯示出規律性。

由圖4可知，超聲處理后果膠溶液的損耗模量(黏性)/貯存模量(彈性)較原始果膠減小，表明超聲處理后果膠溶液更傾向于體現彈性特性。有研究表明，超聲波處理果膠會使其酯化度降低，而低酯果膠形成凝膠的速率會隨著其酯化度的降低而加快，即更易形成凝膠[12]。

A-空白;B-30 min;C-45 min;D-40%;E-60%圖3 不同超聲時間和強度果膠的頻率掃描結果Fig.3 Effects of ultrasonic time and intensity on the storage modulus and the loss modulus with angular frequency in pectin solution

A-超聲時間; B-超聲強度圖4 不同超聲時間和強度對柑橘果膠黏彈性的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time and intensity on viscoelasticity of citrus pectin

2.4 高場強超聲處理對果膠乳化性質的影響

2.4.1 果膠乳液粒度

乳液粒度大小是表征乳液穩定性的一項重要指標，通常情況下，乳液粒度越小、分布越均勻，乳液的穩定性越好[29]。如圖5所示，超聲處理后果膠乳液粒徑顯著減小，且處理時間越長，強度越大，乳液粒徑越小，表明超聲處理可能會提高果膠乳液的穩定性。

A-超聲時間; B-超聲強度圖5 果膠乳液在不同超聲時間和強度處理下的粒度Fig.5 Effects of ultrasonic time and intensity on particle size of pectin emulsion注：同一處理條件下不同大寫字母標注表示0.05水平上有顯著性差異；同一天中不同小寫字母標注表示在0.05水平上有顯著性差異。

已有研究表明，超聲處理可以通過降低乳液的粒度的方式提高乳液穩定性[33-35]。

2.4.2 果膠乳液穩定性

圖6所示為各果膠乳液在4 ℃條件下貯藏后的乳液照片。由圖6可以看出，不同乳液經貯藏后乳化層均發生了肉眼可見的分層現象，但乳化層的高度不同。其中，未處理的果膠乳液分層現象最為嚴重，而隨著超聲強度的增大，分層現象趨于不明顯，表明超聲處理可在一定程度上提高果膠乳液的穩定性。影響乳液穩定性的因素很多，蛋白含量、果膠分子質量分布及構象是其中重要因素，然而，具體的影響機制還需進一步探索研究。

圖6 果膠乳液貯藏穩定性Fig.6 Stability of the O/W emulsions prepared by different citrus pectin over storage

3 結論

本文研究了不同超聲條件(時間、強度)對果膠理化性質、流變特性和乳化特性的影響。由結果可知，超聲波處理不會影響果膠中半乳糖醛酸、蛋白質和總糖含量及組成，但是可能會影響半乳糖醛酸長鏈結構，使果膠分子質量下降、粒度減小，由此導致果膠表觀黏度下降，逐漸趨于牛頓流體。在試驗條件范圍內，處理時間越長、強度越大，果膠表觀黏度下降越顯著。

超聲處理后果膠乳液的粒度減小，且處理時間越長、強度越大，粒度減小越顯著。乳液粒度大小會顯著影響乳液的穩定性，貯藏穩定試驗的研究也發現超聲時間越長、強度越大，果膠乳液的分層越慢，乳球聚集越慢，表明超聲處理可在一定程度上改善果膠的乳化特性。

綜上，超聲波這一處理方法綠色無污染，條件溫和，效果顯著，可以作為一種切實可行的果膠定向降解方法。超聲波處理能夠通過降低果膠分子質量，進而影響果膠表觀黏度及其凝膠、乳化等功能特性。同時，已有研究表明，降解后的小分子質量果膠，能更好地被人體吸收，且相對于高分子質量果膠而言具有更好的生理活性。然而，超聲改性后的果膠在生理學及醫學上的生物利用率及在體內生理活性的變化，還有待我們進一步研究。