β-地中海貧血分子生物學治療研究進展

馬玉媛，劉云春

（大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

β-地中海貧血是一種具有遺傳性的單基因溶血性貧血疾病，發生機制是調控β珠蛋白基因片段的缺失或者突變造成β珠蛋白合成鏈比例失衡。在全世界范圍內，每年出生的患有純合子或雙重雜合子基因型的β-地中海貧血新生兒至少有20萬人[1]，常見發病地區有撒哈拉以南的非洲、地中海地區、中東、印度次大陸以及東亞和東南亞[2-3]，我國則集中在南方，主要發生于華南和西南地區，包括廣東、廣西、海南、四川、云南和貴州等地，其中廣東、廣西、云南以及海南是地中海貧血的高發區[4]。根據其臨床表現，β-地中海貧血可分為輕型、中間型和重型3種，表現為不同程度的進行性溶血性貧血、黃疸、肝脾腫大等，嚴重的會引起死亡。國內目前仍舊以輸血、切脾、造血干細胞移植為主，花費大且治療效果不一[5]，雖然大量的輸血實踐結合鐵螯合療法已取得重大進展，并成功地延長了β-地中海貧血患者的預期壽命，提高了生活質量，減輕了并發癥，增加了生存率，然而，為了獲得最佳的治療效果，必須在不可逆的鐵沉積過多介導心肌、肝、腦組織發生損傷之前盡早開始有效的鐵螯合治療，但是隨著新的螯合劑的引入和心臟，肝臟磁共振成像作為監測鐵超載方法的治療手段，治療成本的增加對于家庭經濟和社會醫療體系都是沉重負擔[6]。以下將對地中海貧血的疾病機制及減少無效紅細胞的生成、鐵過載的調節、基因治療三方面的進展進行論述。

1 疾病分子機制

β-地中海貧血主要是11（p15.5）染色體上β珠蛋白基因點突變引起，也發現有少部分β-地中海貧血是由于β-珠蛋白基因缺失所致[7]。目前，全世界已發現超過200種β-地中海貧血突變型，我國報道發現46種[8］。不同類型珠蛋白鏈間數量失衡以及受遺傳因素和地域環境方面的影響，使得β地中海貧血臨床表型多樣，從無癥狀，貧血到嚴重貧血合并多種并發癥（如肺動脈高壓、血栓形成、感染、內分泌功能障礙和下肢潰瘍等）。按照珠蛋白鏈缺失程度，珠蛋白肽鏈合成減少造成部分缺失的（稱為β+，輕型突變），珠蛋白肽鏈不合成造成完全缺失的（稱為β0，重型突變），不同組合有不同臨床癥狀。

β珠蛋白基因簇位于第11號染色體，包含珠蛋白基因（HBB）以及其他4種類β-珠蛋白基因：胚胎期表達的ε-珠蛋白基因（HBE1）、胎兒期表達的γ-蛋白基因（HBG2和HBG1）和成年期低量表達的δ-珠蛋白基因（HBD），這些珠蛋白基因的表達調控精密，有高度的發育時序性[9]。人類β珠蛋白基因簇隨個體發育的不同階段而出現特異性表達與關閉，存在胚胎→胎兒→成人的轉換，即有兩次開關，分別為ε→γ和γ→β（δ）[10]。從受孕到妊娠5周內，胚胎血紅蛋白主要在卵黃囊中合成，ε-珠蛋白基因在這段時期表達。第一次基因表達切換發生在懷孕后6周左右：ε-珠蛋白基因表達被逐漸關閉，γ-珠蛋白基因表達開啟；從懷孕后12周到胎兒出生這段時間，血紅蛋白F（HbF）是胎兒紅細胞中最主要的血紅蛋白；第二次基因表達切換發生在出生后，γ-珠蛋白基因表達被逐漸關閉，β-珠蛋白基因開始表達；出生6個月后，胎兒血紅蛋白的HbF會下降到血紅蛋白總量的1%以下，成人血紅蛋白HbA達到97%左右，另外2%為HbA2[10]。在對遺傳性胎兒血紅蛋白持續存在綜合征（HPFH）的病人的研究中發現，這是一種由于β-珠蛋白基因簇上的DNA序列缺失或γ-珠蛋白蛋白啟動子區域發生點突變導致的成人紅細胞中持續存在過量的HbF的遺傳性血紅蛋白病，無臨床癥狀，不需要治療。因此，除了直接針對β-珠蛋白基因的表達調控，對γ-珠蛋白基因的表達調控在地中海貧血的治療上有重要作用，通過對γ-珠蛋白基因的一些調節蛋白或轉錄因子進行干預，上調γ-珠蛋白的表達，能為β-地中海貧血的治療提供了更多的研究依據和參考作用。

2 治療進展

2.1 減少無效紅細胞生成的方法

由于珠蛋白基因片段的缺失或者點突變造成珠蛋白合成肽鏈失衡導致無效紅細胞生成是地中海貧血的標志。β-地中海貧血中的β珠蛋白基因部分表達（β+）或表達完全受限（β0）從而使α-珠蛋白肽鏈相對過剩，不能形成穩定的血紅蛋白四聚體，容易氧化沉積形成包涵體沉積在紅細胞膜上，紅細胞變形能力降低，造成紅細胞膜破壞，紅細胞壽命縮短，大量無效紅細胞生成，引起了嚴重的溶血性貧血[11]。無效紅細胞生成是β-地中海貧血患者慢性貧血和復雜多發病率的關鍵病理生理機制，目前正在研究許多針對無效紅細胞生成的藥劑，用于治療由β-地中海貧血引起的貧血。例如，促紅細胞生成素（EPO）、HbF誘導類藥物、鐵調素等，其中Janus激酶2（JAK2）抑制劑-魯索利替尼（ruxolitinib）和激活素受體-Ⅱ藥物-sotatercept（ACE-011）和luspatercept（ACE-536）處于最先進的研究發展階段。

2.1.1 促紅細胞生成素（EPO）

促紅細胞生成素（EPO）是由腎臟在缺氧條件下產生的糖蛋白激素，具有刺激骨髓中紅系祖細胞的生長和分化并防止其凋亡的作用。重組人促紅細胞生成素（rHuEPO）治療β-地中海貧血的基本原理來源于狒狒和小鼠的研究[12-13]，結果證明了rHuEPO對刺激HbF合成有益。臨床研究中，一直將EPO作為誘導HbF合成來增強紅細胞生成的藥劑，但是結果表明在很大程度上是具有變化性和不可預測性的[14-15]。rHuEPO可被視為β-中間型地中海貧血患者定期輸血的安全替代治療，特別是脾切除患者以及初始HbF患者＞40%或低EPO水平患者，但對于嚴重的β-中間地中海貧血患者，需要進一步進行更大規模的臨床試驗以得到更好的治療評估效果[16]。另有研究表明，羥基脲（Hydroxyurea，HU）作為治療鐮狀細胞貧血的主要藥物，同時也是一種核苷二磷酸還原酶抑制劑，存在著誘導HbF生成的作用，在與rHuEPO聯合治療β-中間型地中海貧血患者的過程中顯示有良好的治療優勢和安全性[17]。

2.1.2 Jak2抑制劑

紅細胞生成受細胞外和細胞內因子的復雜信號通路的調節。EPO是紅細胞生成的主要調節因子，EPO經其受體（EPOR）通過多種信號通路主要作用于JAK2/STAT5（Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子5）。Jak2是Jak酪氨酸激酶家族的成員，它與EPO的關聯特別，Jak2是唯一與EPOR相關的激酶，因此也是EPO的唯一信號轉導物[18]，Jak2的激活最終導致信號轉導和轉錄激活因子Stat5a和b以及平行信號通路的激活[18]，促進紅系祖細胞的增殖、分化和存活[19]。通過抑制JAK2/STAT5途徑對β-地中海貧血疾病中EPO過度刺激的負面影響一直是治療探索過程中有吸引力的領域。作為被美國FDA批準的首批JAK2抑制劑藥物之一的魯索利替尼，一開始被批準用于治療患有紅細胞增多癥和骨髓纖維化的患者[20-21]，在治療的結果中表明，JAK2抑制劑在減少脾腫大方面具有臨床療效，但存在相關的副作用，包括血小板減少和貧血[22]，以及疾病癥狀的急性復發[23]；在β-地中海貧血中間型的小鼠模型中已顯示，JAK2抑制劑可改善無效紅細胞生成和逆轉脾腫大[24]，最近報道的一項為期30周的二期臨床試驗中，評估了30例輸血依賴性貧血（TDT）和脾腫大患者使用魯索利替尼的藥物療效和安全性[25]。每天兩次魯索利替尼以10mg的起始劑量口服給藥治療，觀察結果表明平均脾臟體積明顯減少（第30周時從基線減少26.4%；n=25），最常報告的不良事件是上呼吸道感染（8/30）、惡心（6/30）、上腹痛（5/30）、貧血（5/30）、腹瀉（5/30）和體重增加（5/30）[25]。由于紅細胞輸注量略有減少，但并未減少輸血需求，輸血前血紅蛋白水平也并未有相關改善，導致沒有計劃對TDT進行進一步的研究。JAK2抑制劑將會是一種有效的治療選擇，理想情況下，JAK2抑制劑可以有助于減少重型β-地中海貧血的輸血，緩解非輸血依賴性地中海貧血的脾腫大和無效紅細胞生成的情況，但其安全性和耐受性目前還尚在研究中。

2.1.3 激活素受體藥物（TGF-β超家族）

TGF-β超家族由4組在細胞水平上具有相似結構和調節活性的蛋白質組成：TGF-β、BMP（骨形態發生蛋白）、GDFs（生長和分化因子）和激活素。GDFs或激活素的抑制劑可能對紅細胞生成的晚期具有積極的影響，在由無效的紅細胞生成引起的貧血，如β-地中海貧血等疾病中具有治療作用[26]。激活素受體-Ⅱ藥物是在細胞外與配體結合的試劑，并且用于阻止在預期受體上的信號傳導。它們最初是通過抑制激活素依賴性信號傳導來預防破骨細胞依賴性骨吸收，用于改善絕經后婦女的骨密度，但結果意外發現Hb值有了顯著的增加[27]。針對激活素受體-Ⅱ（ActRIIA或ActRIIB）開發了兩種藥物——Sotatercept（ACE-011）和Luspatercept（ACE-536），用于治療與無效紅細胞生成相關的病癥。

Luspatercept和sotatercept是結合轉化生長因子β（TGF-β）家族配體的重組化合物，是激活素ⅡB型和ⅡA型受體（ActRIIB和ActRIIA）修飾受體，與人免疫球蛋白IgG1的Fc部分融合。因此，它們分別阻止TGF-β超家族配體結合ActRIIB和ActRIIA，抑制通過下游信號傳導對Smad2/3通路傳導的抑制作用。相對于激活素或其他TGF-β家族成員（例如GDF11）來說，它們具有更強的結合能力[28]，在臨床的Ⅰ期和Ⅱ期的初始研究表明[29-30]，使用Luspatercept和sotatercept藥物的治療實驗中，地中海貧血人群耐受性良好，血紅蛋白水平得到提高，貧血程度改善，輸血負荷減少，但確定具有輸血依賴性或非輸血依賴性β-地中海貧血的成人中可接受的活性劑量還需要在后期的Ⅲ期研究中進行延續性觀察。

2.1.4 HbF誘導

自從發現具有胎兒Hb遺傳性持續存在的地中海貧血患者（HPFH）具有不太嚴重的表型[31]以來，研究人員一直致力于提高胎兒Hb（HbF）水平，將胎兒血紅蛋白（HbF）合成的再活化作為減輕β-血紅蛋白病癥狀的可行性策略。開發新的基因組工具已經確定了血紅蛋白轉換的重要天然遺傳修飾因子，包括BCL11A、KLF1、HBSIL-MYB、LRF、LSD1、LDB1、組蛋白脫乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）。miRNA也是有希望的治療靶標，用于誘導HbF產生，是更有效的新策略。許多新的HbF生產的小分子藥理學誘導劑已經處于臨床前期和臨床開發階段，例如甲基化抑制劑（5-氮雜胞苷、地西他濱、羥基脲）、細胞毒性和組蛋白去乙酰化酶抑制劑、如丁酸鹽衍生物。

最近的分子研究加深了我們對有希望的分子靶標的理解，例如BCL11A、KLF1、MYB、LRF和影響HbF沉默的miRNA。然而，在將這些潛在的遺傳修飾物轉化為臨床治療之前，需要進行更多的臨床前研究[32]。

2.1.5 Forkhead-box-O3（Foxo3）

Forkhead-box-O3（Foxo3）是一種關鍵的轉錄因子，發揮著許多基本的生物學功能，包括細胞周期調控、細胞凋亡、DNA修復和代謝和最重要的抗氧化作用，Foxo3通過在紅細胞生成的早期階段上調抗氧化酶來保護細胞免受氧化應激[33]。Foxo3的失活將導致細胞周期改變與成紅細胞前體的延遲成熟以及氧化應激介導引起晚期成紅細胞的氧化損傷和壽命減少。因此，foxo3在減少無效紅細胞生成的過程中發揮著重要作用，雖然在血紅蛋白中的作用機制仍待闡述，但作為潛在的HbF誘導劑的Foxo3的活化可有利于改善β-地中海貧血中的貧血。在β-地中海貧血中間型小鼠中，已經發現Foxo3由于EPOR-pI3K/AKT/mTOR途徑的持續激活而下調，使用雷帕霉素（mTOR抑制劑）在β-地中海貧血中間型小鼠模型中，觀察到通過Foxo3的激活顯著改善紅細胞成熟，促進了β-珠蛋白產生和緩解貧血狀況[34]。二甲雙胍作為二型糖尿病治療的批準藥物，同時能作為是Foxo3誘導劑，能通過激活Foxo3誘導HbF的紅細胞表達。最新研究[35]表明，在鐮狀細胞性貧血和非依賴性輸血地中海貧血患者正在進行的Ⅰ期臨床試驗中正在研究其作為HbF誘導劑的用途，雖然已證明二甲雙胍能增加紅細胞祖細胞中Foxo3的活性，并且在與羥基脲的聯合使用中具有累加效應，但正在臨床前研究階段，這些藥物需要進一步的評估觀察。

2.2 鐵過載的調節治療方式

目前，監管機構已批準3種鐵螯合劑用于治療β-地中海貧血患者的鐵過載，其中去鐵胺是第一種市售的鐵螯合劑，半衰期短需通過皮下注射長時間給藥，另外兩種口服活性鐵螯合劑——去鐵酮、地拉羅司的引入代表了β-地中海貧血患者管理的巨大進步。雖然3種鐵螯合劑的短期臨床療效相似，但不同器官的療效可能不同，并且受到可用性、功效和安全性問題的限制，去鐵酮和地拉羅司都需要密切和持續的監測以防止不良反應發生。出于需要長期堅持治療和總治療費用的考慮，它的治療滿意度仍不是最理想的。此外，FBS0701作為新型的口服去鐵藥，目前已完成臨床Ⅱ期研究，其不良反應要比地拉羅司少1/4，對腎功能影響較小[36]，但較少的臨床Ⅰ、Ⅱ期的報道中研究對象僅針對輸血依賴型的鐵過載患者，也許在后面的臨床Ⅲ、Ⅳ期研究中也會將非輸血依賴型的鐵過載患者納入研究對象，進一步擴大診治范圍深入研究。針對鐵過載的調節治療方式，現在正在從改善鐵調素，調控鐵轉運蛋白及相關分子方面開展著研究。

2.2.1 改善鐵調素

鐵調素（Hepcidin）是體內調節鐵代謝的重要激素，由HAMP基因編碼，生物活性形式的hepcidin是25個小分子氨基酸多肽組成的[37]，主要由肝細胞分泌，通過血液循環發揮作用。無效紅細胞生成和慢性組織缺氧抑制鐵調素在肝臟合成和分泌。hepcidin的體內低循環水平，又增加了十二指腸攝取鐵，從網狀內皮系統再釋放鐵，最終肝臟鐵儲存過多導致鐵過載。在β-地中海貧血小鼠模型中過度表達hepcidin可改善無效紅細胞生成，增加血紅蛋白水平，逆轉脾腫大和鐵超負荷[38]。由此，可以通過調控hepcidin的水平來預防β-地中海貧血中的原發性鐵超負荷，并且可能減少現有的鐵負荷。最近研究發現，Minihepcidins是一種模擬內源性hepcidin活性的短肽[39]，這種微量鐵調素的使用顯著改善了小鼠模型中的無效紅細胞生成、貧血和鐵超負荷，有很好的治療效果。還有報道發現，TMPRSS6是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，可減少鐵調素的產生[40]，因此可以通過降低TMPRSS6的表達來刺激內源性鐵調素的產生。來自地中海貧血小鼠模型的結果表明，TMPRSS6基因的缺失改善了貧血并減少了無效的紅細胞生成，脾腫大和鐵負荷[41]。有實驗表明，使用靶向TMPRSS6的反義寡核苷酸或小干擾RNA已被證明可改善小鼠和其他β地中海貧血臨床前模型的貧血和鐵超負荷[42]。非輸血依賴性地中海貧血（NTDT）患者比使用輸血依賴性地中海貧血（TDT）的患者更有可能從操縱鐵調素表達的藥物中獲益，而微型鐵調素和TMPRSS6抑制劑仍值得用于輸血依賴性地中海貧血（TDT）患者治療的評估。以鐵調素為靶點研發新藥或許能面向更廣泛的地中海貧血人群疾病的治療，因此，現在也逐漸成為地中海貧血治療研究的一個關注熱點。

2.2.2 調控鐵轉運蛋白及相關分子

鐵轉運蛋白將鐵從腸細胞輸出到血液循環，并在鐵穩態中發揮重要作用。腸道缺氧誘導因子-2α（HIF2alpha）是鐵轉運蛋白調節鐵含量變化的一個關鍵因子。在地中海貧血小鼠模型中，HIF2alpha在β-地中海貧血的發病機制早期被激活，并有助于鐵的積累，HIF2alpha信號的破壞可以糾正β-地中海貧血小鼠模型中的鐵超負荷[44]。

2.3 基因編輯和基因治療

2.3.1 基因編輯

基因編輯技術的產生使得基因突變疾病的治愈成為了可能，基因編輯技術可以實現對特定位點基因進行“編輯”，修飾造血干細胞的內源DNA。常用的基因編輯技術有鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）、規律成簇間隔短回文重復基因編輯技術（（CRISPR/Cas9）。在可編程靶向核酸酶應用之前，主要是通過外源性引入染色體模板觸發哺乳動物細胞內同源重組途徑[45]，在沒有其他核酸酶的情況下，利用聚核苷酸來觸發同源重組途徑，同時利用病毒攜帶基因作為模板進行基因編輯[46]。當前，使用最多病毒載體包括逆病毒載體（Retro virus vector，RV）和腺病毒相關病毒（Adenovirus associated virus，AAV）載體。RV具有宿主范圍廣、轉染效率高，整合的外源基因可在靶細胞中永久表達等優點，但存在明顯的遺傳穩定性、使用安全性等方面的隱患；AAV安全性雖然相對較高，但感染效率偏低，亦可能引起免疫排斥等方面不足。當前實驗表明，慢病毒（Lentiviral，LV）是基因治療的最為有效的轉移載體[47]。但是，反轉錄病毒整合可能干擾基因功能，同時也存在一定誘發癌變的風險。基因正確導入和基因充分表達是首要的關注問題。涉及基因組的同源重組，以慢病毒作載體導入患者體內，而動物實驗表明慢病毒能激活原癌基因，增加腫瘤發生的風險以及可能發生基因移位隨機插入導致基因表達不足的問題[48]。優化載體的構建，提高轉染的效率和保證載體的穩定也是目前研究需要解決的關鍵問題。

針對地中海貧血疾病而言，許多患者的β-地中海貧血的發生是單個位點突變引起，這有助于使用基因編輯策略進行校正。但β-地中海貧血相關的眾多突變超過200多種，突變位點因地域不一，存在高度異質性，因此基因編輯運用的一個關鍵挑戰是確定有利于廣泛人群的分子靶標。

2.3.2 基因治療

β地中海貧血的基因治療根據分子機制可以通過修復β-珠蛋白基因（HBB），或者重新激活γ-珠蛋白基因（HBG）誘導HbF的增加，平衡α和β-珠蛋白肽鏈的比例，改善紅細胞生成，從而達到有效治療目的。

使用自體干細胞的基因治療可以作為造血干細胞移植（HSCT）另一種治療方法，HSCT僅限于具有適當匹配供體的患者。分離造血干細胞和祖細胞（HSPCs），使用慢病毒載體將外源性β-或γ-珠蛋白基因整合到宿主細胞基因組中。在完全或部分清髓后，遺傳修飾的自體HSPC返回患者，其中修飾的細胞重新填充造血。人類CD34[49]細胞的慢病毒載體轉導現已成為一種成熟的技術，在一些患有嚴重聯合免疫缺陷或代謝紊亂的患者中產生了治愈反應，這種方法使用相對較弱的增強子和啟動子，迄今已被證明是安全的。還有依賴于靶向基因編輯的替代方法，如利用CRISPR/Cas9系統在β-地中海貧血患者的人造血干細胞（CD34+）上將α-珠蛋白MCS-R2增強子進行刪除突變，形成α-地中海貧血。編輯后的CD34+細胞分化為成熟紅細胞，導致減少α-珠蛋白表達，糾正肽鏈中的α與β珠蛋白的不平衡，改善了病理狀況[50]。由于在真正的造血干細胞（HSC）中存在核酸酶有效編輯靶向基因組DNA的困難，靶向基因遞送方法在臨床適用性受限。在使用靶向編輯做基因治療研究的同時需要更好地定義靶核酸酶的遺傳毒性（脫靶活性），通過不斷改進和完善，有望成為治療β-地中海貧血最適合的手段。

3 結語

地中海貧血作為全球分布最廣泛、危害最大的遺傳性疾病，其管理和治療在全球都是巨大的負擔。十幾年來，β-地中海貧血的管理與治療都取得了很大的進步，新型分子靶向藥物的研發針對不同類型的地中海貧血患者都取得了一定的療效，一些在臨床前期研究的藥物，雖然存在很多的治療局限性和病理機制的不明確，但有很大發展潛力有待改善和明確。基因治療在β-地中海貧血治療中有很大的前景，大量實驗證明方法的有效性的同時也要關注其治療的遠期療效和安全性。隨著疾病相關機制的不斷明確，一些藥理學或遺傳學的新治療靶點有望被繼續發現。