老鸛草鞣質(zhì)與總黃酮的提取工藝研究進(jìn)展

劉利民,姚松梅,李 洋*

(1.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司南京研究院，江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 )

老鸛草為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗Erodium stephanianum Wild、老鸛草Geranium wilfordii Maxim，或野老鸛草Geranium carolinianum L.的干燥地上部分。其味辛、苦，性平，具有祛風(fēng)濕，活血，止瀉痢等功效，可用于治療筋骨疼痛，痹癥，麻木，泄瀉痢疾等病癥[1]。鞣質(zhì)和黃酮類是其重要藥效成分，鞣質(zhì)是一種多元酚類化合物，此類化合物具有收斂、抑菌、抗病毒、抗氧化、降血壓等作用[2]；黃酮類天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖等作用。因此，開發(fā)利用老鸛草的藥用植物資源，優(yōu)化老鸛草總鞣質(zhì)與總黃酮的提取工藝，對擴(kuò)大其應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義。目前，對鞣質(zhì)與總黃酮的提取多采用超聲和回流提取，多數(shù)對溶劑的濃度與用量、提取時間、液料比、提取溫度等進(jìn)行考察研究。本文總結(jié)了提取鞣質(zhì)和總黃酮的多種工藝方法，以期為更好地開發(fā)利用老鸛草資源奠定基礎(chǔ)。

1 鞣質(zhì)的提取

鞣質(zhì)的提取方法有多種，主要有回流提取法、纖維素酶酶解法、水溫浸法、超聲提取法、超臨界CO2提取法。以相關(guān)物質(zhì)的提取率為指標(biāo)，考察對提取率產(chǎn)生影響的各因素，從而確定最佳提取工藝。

1.1 回流提取法

尹海波等[3]比較了乙醇熱回流、乙醇冷浸及甲醇超聲三種提取方式，發(fā)現(xiàn)從提取效率和節(jié)約成本的角度，乙醇熱回流方法最優(yōu)。采用正交設(shè)計法，以沒食子酸的提取率為考察指標(biāo)，考察對提取率產(chǎn)生較大影響的四因素，即乙醇的濃度與用量，提取次數(shù)與提取時間，最終確定提取工藝為30倍30%乙醇提取3次，每次1h。通過設(shè)計驗證性試驗，發(fā)現(xiàn)使用該提取工藝后，鞣質(zhì)的提取效率較高，操作可控，節(jié)省物料。而辛聰?shù)萚4]以紫外分光光度法測定的鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，調(diào)整提取溫度，采用均勻設(shè)計試驗考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度和乙醇用量四因素，用回流法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。優(yōu)選出最佳提取工藝為乙醇濃度40%，提取兩次，溶劑用量24倍(12倍、12倍)，提取時間6h(3h，3h)，提取溫度80℃，老鸛草中鞣質(zhì)的提取量為3.498%。李京杰等[5]通過單因素試驗研究鞣質(zhì)提取率的影響因素，包括提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度等。利用中心組合試驗設(shè)計對老鸛草總鞣質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化出老鸛草總鞣質(zhì)的最佳提取工藝條件為：老鸛草粉末與71%乙醇的比例1∶18于83℃恒溫回流2h，提取3次，鞣質(zhì)的提取率為13.55%，與之前鞣質(zhì)提取率相比有了提高。谷靜逸等[6]用50%甲醇、水、75%乙醇作為考察溶劑，采用回流的提取方式，設(shè)計了3種實驗方案：50%甲醇回流2次；水回流2次；75%乙醇回流1次與水回流1次混合。結(jié)果表明，75%乙醇和水各回流1次后既能使老鸛草素水解完全，又能讓樣品中諸如柯里拉京、沒食子酸成分的含量不被降低，所以采用75%乙醇+水各回流提取1次后混合提取鞣質(zhì)。與谷靜逸選擇的提取方法相反，李祎等[7]選擇水回流提取，而且該工藝明顯提高了主要活性成分總鞣質(zhì)的提取率，總鞣質(zhì)提取率高達(dá)25.29%。實驗不僅僅將總鞣質(zhì)含量作為考察指標(biāo)，還將浸膏得率和柯里拉京含量納入考察依據(jù)，對影響因素如提取的溶劑、溫度、時間、次數(shù)以及加水量等進(jìn)行考察，確定老鸛草總鞣質(zhì)的最佳提取工藝為：老鸛草粉末+20倍量的水于100℃下回流2h，回流兩次。

1.2 酶解法

酶解法在工藝操作、工藝成本、設(shè)備要求等方面都優(yōu)于有機(jī)溶劑提取中藥成分。酶解法適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，并且酶解法提取率高。鄭玲玲等[8]以用比色法測定的鞣質(zhì)含量為評價指標(biāo)，用纖維素酶酶解法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。將纖維素酶用量、酶解時間和酶解溫度作為考察因素，進(jìn)行正交設(shè)計實驗。最終確定的最佳提取工藝為：酶用量為10U/g，酶解溫度為60℃，酶解時間為60min。在不加酶的情況下，按照工藝條件進(jìn)行水提取，結(jié)果根據(jù)吸光度值可判斷酶解法優(yōu)于水提法。

1.3 水溫浸法

鞣質(zhì)的極性較強(qiáng)，所以提取溶劑選擇極性較大的水和有機(jī)溶劑。閻巧娟等[9]采用水回流法、水溫浸法、丙酮回流法、冷浸攪拌法和乙醇回流法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。水回流較水冷浸提取率高，但鞣質(zhì)遇熱易氧化變性，所以水回流不適合作為提取鞣質(zhì)的最佳方法。采用水溫浸法、丙酮回流法和乙醇回流法提取的鞣質(zhì)的含量都較高，但水溫浸法具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，所以最終將水溫浸法作為提取鞣質(zhì)的最佳方式。王放銀等[10]通過正交試驗確定影響鞣質(zhì)提取的主要因素為料水比，其次是浸提溫度，最后是浸提時間，優(yōu)選出最佳工藝條件為：料水比1∶30、浸提溫度80℃、浸提時間30min。

1.4 超聲提取法

與傳統(tǒng)的溫浸提取法相比，循環(huán)超聲法提取率高，提取時間短，溶劑用量少。鄭明昱等[11]采用干酪素法測定鞣質(zhì)含量，考察提取溶劑、提取時間、超聲功率等因素對鞣質(zhì)提取率的影響，確定工藝條件為12倍量40%乙醇超聲提取1h，間隔超聲比0.6∶0.5s，超聲功率500W，并且設(shè)計溫浸提取對比試驗，結(jié)果鞣質(zhì)提取率明顯低于該超聲提取法。鞣質(zhì)提取后需要進(jìn)行分離純化，減壓分離提取溶劑。因為鞣質(zhì)極性強(qiáng)且50℃以上易氧化，因此應(yīng)該采用沸點低且同樣具有較強(qiáng)極性的溶劑，所以史偉國等[12]選擇極性強(qiáng)、沸點低的丙酮作為提取溶劑。將老鸛草粉末置于丙酮溶液中浸泡后于常溫下超聲，提取鞣質(zhì)。考察丙酮的適宜濃度及用量，浸泡和提取的時間，以總鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，用EDTA絡(luò)合法滴定。最終從耗時和節(jié)能的角度選定提取工藝為：用30%丙酮10倍量浸泡12h超聲提取60min。鄭玲玲等[13]利用明膠沉淀老鸛草中總鞣質(zhì)，再利用丙酮溶解明膠沉淀物中總鞣質(zhì)，初步純化出老鸛草中總鞣質(zhì)類成分。也有學(xué)者采用12%交聯(lián)瓊脂糖凝膠吸附色譜法一步分離純化了老鸛草中可水解的鞣質(zhì)，采用5%乙醇和5%乙酸組成的流動相A和30%乙醇和30%乙酸組成的流動相B梯度洗脫法進(jìn)行分離，純度及產(chǎn)率都較高[14]。

1.5 超臨界CO2提取法

有學(xué)者為了優(yōu)化超臨界CO2提取老鸛草中鞣質(zhì)的工藝條件，用磷鉬鎢酸-干酪素比色法測定鞣質(zhì)的含量，以老鸛草鞣質(zhì)的提取含量為指標(biāo)，考察提取壓力、提取溫度和提取時間三個影響因素，通過正交試驗對工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定最佳工藝條件為：提取壓力25MPa，提取溫度為500℃，提取時間為1.5 h[15]。

2 總黃酮的提取

黃酮類化合物一般難溶或不溶于水，可溶于甲醇，乙醇等有機(jī)溶劑，所以總黃酮的提取多用乙醇作為提取溶劑。目前老鸛草總黃酮的提取可采用回流提取法、超聲提取法、乙醇滲漉法、微波輔助乙醇萃取法。

2.1 回流提取法

王洪成等[16]采用先水回流再乙醇回流的方法使老鸛草素充分水解同時又可提取出黃酮類成分。朱明慧等[17]通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化老鸛草總黃酮的提取工藝。以總黃酮得率為指標(biāo)，用單因素試驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時間、溶劑用量和提取溫度四因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)星點設(shè)計原理優(yōu)化出總黃酮的提取工藝為：加35倍量65%乙醇于90℃回流提取2次，每次70min。尹海波等[18]比較了超聲提取法、乙醇冷浸法、乙醇回流法，結(jié)果超聲提取法、乙醇冷浸法和乙醇回流法所得樣品中總黃酮的平均含量依次為0.0964%、0.0906%、0.4687%。相比而言乙醇回流提取的總黃酮得率較高，所以采用乙醇回流法設(shè)計正交試驗。以老鸛草藥材總黃酮的提取率為指標(biāo)，考察對總黃酮提取率產(chǎn)生較大影響的四因素：乙醇濃度及其用量，回流時間和回流次數(shù)，最終將提取工藝優(yōu)化為4倍量90%乙醇提取3次，每次1h。杜列勇等[19]首先確定了提取所用的乙醇濃度為60%，在確定醇濃度的基礎(chǔ)上，依據(jù)總黃酮的提取量，選擇乙醇用量、提取時間和提取溫度為考察因素，再設(shè)計正交試驗確定提取總黃酮的最佳工藝條件為：老鸛草粉末加20倍量的60%乙醇于80℃下回流75min。在預(yù)試中發(fā)現(xiàn)，一定時間內(nèi)，提取出的有效成分隨著時間的增加而增加，提取出的雜質(zhì)也隨時間的增長而相應(yīng)增多。一定時間過后，總黃酮提取率不再明顯增加但雜質(zhì)仍繼續(xù)增多，所以為了便于提取后的分離純化，選擇回流75min。經(jīng)過試驗驗證，該工藝條件可行且可以作為大生產(chǎn)的參考工藝條件。

2.2 超聲提取法

周慶頌等[20]采用乙醇超聲提取總黃酮，比較了30%～90%乙醇等不同提取溶劑，發(fā)現(xiàn)70%乙醇超聲提取黃酮的總含量較高且干擾雜質(zhì)最少，所以用70%乙醇作為提取溶劑，超聲提取總黃酮。但是也有學(xué)者認(rèn)為60%乙醇提取總黃酮的量相對較多，劉青林等[21]先對所用溶劑進(jìn)行了50%、60%、70%、75%、80%五個乙醇濃度對比研究，發(fā)現(xiàn)用60%乙醇提取總黃酮的量較多，溶液雜質(zhì)較少，所以確定選用60%乙醇提取。之后劉青林等比較了回流、超聲、滲漉這三種提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲法提取的總黃酮量較多且從操作的角度考慮，超聲法提取總黃酮操作更為方便。

2.3 乙醇滲漉法

秦哲等[22]為了獲得經(jīng)濟(jì)實用的老鸛草中黃酮類物質(zhì)的提取方法，以乙醇為提取溶劑，分別運用滲漉法與超聲提取法提取老鸛草中總黃酮類化合物，用比色法測定總黃酮含量，并對兩種提取方法進(jìn)行了比較。雖然試驗結(jié)果與劉青林所下的結(jié)論一致，超聲提取法提取的總黃酮的量高于滲漉法，但綜合提取效率、提取成本等因素，秦哲等認(rèn)為乙醇滲漉法更適合老鸛草總黃酮的提取。

2.4 微波輔助乙醇萃取法

微波萃取技術(shù)不同于傳統(tǒng)萃取技術(shù)，它速度快，往往只需要幾分鐘，提取率高且試驗結(jié)果重現(xiàn)性好。趙志添等[23]將過篩的老鸛草粉末置于一定量的乙醇溶液中萃取，將提取液在一定的微波功率下微波處理一段時間，過濾完全后，用明膠沉淀法除去濾液中的鞣質(zhì)，得到總黃酮。先進(jìn)行單因素試驗，以確定適宜的乙醇濃度、液料比以及微波參數(shù)如功率、時間等。實驗結(jié)果表明，乙醇濃度在40%～90%時，總黃酮得率先增后減，在乙醇濃度為70%時，總黃酮得率最高；液料比在10～30mL/g時，總黃酮得率先明顯增加，液料比到達(dá)20mL/g后再增加液料比，總黃酮得率增加不明顯，接近平穩(wěn)，所以液料比在20mL/g時既能節(jié)省物料又能使提取出的總黃酮的量接近最多；隨著微波功率的增大，總黃酮得率先升后降，微波功率在385W時，總黃酮得率為最大值；雖然微波時間延長可能會使反應(yīng)更加完全，總黃酮的提取率升高，但是超出合適的微波時間后，提取液會噴濺從而造成損失，微波時間處于2min時可使提取率達(dá)到最高。再設(shè)計正交試驗，以確定對總黃酮得率產(chǎn)生影響的因素的主次。最終確定的最佳工藝條件為乙醇濃度70%，液料比20mL/g，微波時間2min，微波功率385W。

3 總結(jié)與展望

老鸛草在我國資源豐富，分布廣泛，其主要活性成分鞣質(zhì)和總黃酮的提取方法有多種，即使提取方式相同，選用的提取溶劑濃度用量、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度不同，也會造成提取率的不同。就回流提取法提取鞣質(zhì)而言，影響因素的選擇不同，就會造成鞣質(zhì)得率3.498%、6.32%、13.55%、25.29%的差異。因此，不僅要考察提取方式也要重視影響因素的考察研究。先進(jìn)提取技術(shù)的發(fā)展，將極大地提高老鸛草鞣質(zhì)與總黃酮的提取效率，提取工藝的不斷優(yōu)化也將使老鸛草具有良好的應(yīng)用前景。