大腸菌群主要檢測方法研究進展

寧倩倩

(1.江西科技師范大學有機功能分子研究所，江西 南昌 330013；2.江西省有機功能分子重點實驗室，江西 南昌 330013)

引 言

公共安全和環境保護需要安全飲用水，這意味著它必須不含致病菌。在水源傳播的病原體中，腸道病原體是最常見。因此，人類活動水域中的糞便污染源必須嚴格控制[1]。為了對水質微生物做出及時性評價，致病菌的快速有效檢測就顯得尤為重要。傳統檢測方法(包括分離培養和生化鑒定等)對病原體檢測的特異性和靈敏性低、操作繁瑣且費時，不能滿足現階段水質評價需求。近些年來，酶底物法由于其自身的一些優勢迅速發展起來，已經廣泛用于水質微生物評價。

1 酶底物法的研究進展

隨著對傳統檢測方法的進一步研究，發現其存在一些局限性，包括潛伏期長等問題。酶底物法是基于細菌的特定酶活性(例如，β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶)檢測大腸菌群的一種方法[2]，因為其自身的特異性而廣受研究者關注。

2016年，卜曉紅[3]使用酶底物法和多管發酵法對大腸菌群進行檢測。對比30份樣品的總大腸菌群MPN檢測結果，通過配對t檢驗對測試結果進行分析，發現兩種方法的檢測結果基本相同，差異無統計學意義。同年，蔣玲等[4]在此基礎上對于同一受試對象分別接受2種不同處理方法采用配對t檢驗分析，同樣驗證了該結論。隨后，鄧永宏等人[5]分別使用乳糖膽鹽發酵法、乳糖蛋白胨發酵法、51孔定量圓盤法、97孔定量圓盤法四種方法檢測水樣中的大腸菌群含量。結果顯示：乳糖膽鹽發酵法的陽性檢出率為58.8%，乳糖蛋白胨發酵法的檢出率為61.8%，酶底物法的檢出率為73.3%。結果表明：51孔定量圓盤法相比于多管發酵法的靈敏性更高，但是定量范圍比較窄；97孔定量圓盤法的靈敏性和定量范圍都比多管發酵法的好。同年，褚福敏等人[6]系統地研究了濾膜法和酶底物法。選取城市供水中不同類別的樣品進行腸球菌的檢測，以加標純水和兩種水源水為研究對象，開展了3組酶底物法和濾膜法的精密度對比試驗，由于腸球菌的含量較低，兩種方法的精密度均不是很好，但是，酶底物法的靈敏度明顯比濾膜法高。

2017年，劉瑞等[7]使用酶底物法、多管發酵法和快速紙片法這三種方法測定了糞大腸菌群的含量。這些方法的假陰性率和假陽性率都為零。對比這三種方法質控樣品的平均值，結果顯示三者均在質控樣品數量范圍內(180 CFU/mL～1 100 CFU/mL)，而相較于質控樣品指定值(580 CFU/mL)，酶底物法略高。因此，酶底物法用于中國水環境監測，其評價標準和適用范圍尚需大量實驗數據加以修正和驗證。后來，李斯婷等[8]6位檢測人員同時用酶底物法與平皿計數法對生活飲用水水樣進行菌落總數對比測試，并對兩種方法的檢測結果進行了配對t檢驗，結果顯示檢測數據存在相關性，且相關程度很高，具有一致性和穩定性。表明酶底物法可以替代平皿計數法。隨后，劉玉紅等[9]又對比分析了樣品處理過程、數據讀取方法、標準樣品以及實際水樣檢測數據的準確性和準確性。結果表明：酶底物法樣品處理時間只需30 min左右，而且菌落清晰，在紫外燈下分布均勻，標準樣品的測量結果在允許誤差范圍內。平板計數法對標準樣品的測量結果同樣在允許誤差范圍內，但是使用平板計數法處理樣品需要2 h以上，菌落大小有所不同、分布不均勻。另外，楊曉冉等人[10]在無菌處理室、非無菌實驗室以及室外環境中測試了大腸菌群。結果表明，實驗環境的無菌性對酶底物法測定水中大腸菌群的影響很小。因此，酶底物法可以很好地彌補傳統方法的一些不足，有望替代傳統方法在常規監測和應急污染事故中做出快速評價。

2018年，劉寧[11]采用實際水樣測試和加標測試方法，通過酶底物法和多管發酵法檢測水樣中大腸菌群的含量。分析對比了實驗數據，發現實驗結果基本相同，差異無統計學意義。但是，大多數的多管發酵法使用的都是半成品培養基，經實驗室配置后再用于樣品檢測，需采取一系列的準備工作，任何環節的任何誤差都可能會導致測試結果出現偏差。因此，酶底物法可用于大腸菌群的含量測定，可以更好地替代多管發酵法用于評價水中微生物。

2019年，張會強等[12]同時使用多管發酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在相同的取樣量和培養條件下對水樣進行檢測，并同時將酶底物法、紙片快速法和濾膜法的檢測結果分別與經典的多管發酵法進行了對比分析。從方法的檢出限來看，紙片快速法的檢出限為20 MPN/L。多管發酵法和酶底物法的最低檢出限同為3 MPN/L；濾膜法不受取樣量限制，檢出限最低。從實驗操作來看，多管發酵法和濾膜法都需要培養基的準備和復發酵過程，操作繁瑣；然而紙片快速法和酶底物法不需要配制培養基，操作簡便。因此，多管發酵法工作量大，耗費時間長；濾膜法操作強度和耗費時間略低于多管發酵法；酶底物法和紙片快速法操作簡便，更適合于大量樣品的快速測試。從定量菌株檢測結果來看，酶底物法的準確性和精密度均優于其他三種方法。從相關性對比來看，多管發酵法與紙片快速法、酶底物法之間無顯著差異，而與濾膜法存在顯著性差異。

2 酶底物法的優缺點

近些年，酶底物法在評價水質微生物方面起著至關重要的作用，所以急需清楚了解酶底物法在水質微生物檢測中的優缺點。本文從實驗操作、人員配置、檢驗成本、靈敏度、精密度等方面對酶底物法進行了綜合評價。

2.1 實驗操作

多管發酵法需要通過初發酵、鏡檢、復發酵等一系列試驗，步驟多、時間長、操作繁瑣，而酶底物法不用配制培養基。

2.2 人員配置

由于基層實驗室的人員配備不夠，需要節省人力成本，步驟簡便的酶底物法特別適合在基層實驗室推廣應用。

2.3 檢驗成本

酶底物法雖然成本貴，但是，該方法是通過糞便大腸菌群釋放的特異性酶和與其作用的特異性酶底物產生的特異性酶促反應來進行大腸菌群含量測定的，具有快速準確檢測的特征，并且實驗操作人員不需要很強的專業性，檢測周期短，過程簡單，較少受人為污染，能夠準確判斷水樣的受污染狀況。

2.4 靈敏度、精密度

與傳統的多管發酵法相比，酶底物法的假陽性和假陰性率較低，操作簡單快速，時間較短，重現性較好，加快了分析速度，提高了工作效率。與濾膜法相比，酶底物法的檢驗周期以及結果的準確性和靈敏性具有明顯的優勢。

3 結論

酶底物法在檢驗周期、設備設施投資等方面較濾膜法有明顯優勢，酶底物法實驗過程中將一次性取樣瓶更換為可多次重復使用的玻璃瓶，檢驗成本有所降低，但是，單次的檢驗成本仍略高于濾膜法。將酶底物技術與膜技術相結合的酶底物濾膜法，其不需要染色鏡檢和復發酵的確認測試，只需24 h的培養過程即可計數特征顏色的細菌菌落并獲得相應結果，因此，它有助于現場檢測大腸菌。目前，酶底物法在國內正逐步開始推廣，但是由于該方法的成本較高，還沒有被廣泛使用。如果將來試劑、耗材價格能有所下降，水樣的測定范圍能進一步提高，一定會得到更好的推廣。