結直腸癌肝轉移動物模型研究進展*

喬大偉 李玉芳 李勝男 肖 云 姜禮雙 孔桂美 卜 平,3

(1. 揚州大學醫學院，揚州 225001)(2. 江蘇省中西醫結合老年病重點防治實驗室，揚州 225001) (3.江蘇省蘇北人民醫院消化內科，揚州 225001)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大癌癥和癌癥死亡的第四大原因[1]。近年來我國結直腸癌發病率和死亡率呈逐步上升趨勢, 結直腸惡性腫瘤在腫瘤發病率中占據第5位[2]。肝臟是CRC最常見的遠處轉移部位，結直腸癌肝轉移(colorectal cancer liver metastases，CRLM)嚴重影響CRC預后。約15%～25%CRC病人在確診時即合并有肝轉移，另有15%～25%病人在行CRC原發灶根治術后發生肝轉移，其中80%～90%肝轉移灶無法獲得根治性切除。且只有15%～20%CRLM患者適合手術切除,術后5年存活率僅為20%～40%。因此選擇合適的CRLM動物模型，對研究CRC發生發展及肝轉移的機制及正確評價各種治療方案的療效，提供與臨床應用相關的證據等有重要作用。現將CRLM動物模型的構建方法綜述如下。

1 原位種植模型

CRC的原位種植模型根據植入的位置分為原位盲腸種植模型和原位直腸種植模型。

1.1 原位盲腸種植模型

原位盲腸種植模型包括癌細胞直接種植、直接縫合原位植入、盲腸接種OB醫用膠粘貼法、盲腸造疝原位接種法及結腸造口移植法等。Goodwin 和Huang[3]通過盲腸壁植入CT-26 FL3細胞建立原位CRLM模型，來評估藥物的抗癌功效，發現此種造模方法具有高侵襲性和高轉移性。Tao 等[4]通過原位盲腸植入HCT-116細胞，建立原位盲腸種植模型，研究胃腸安(WCA)和5-氟尿嘧啶(5-FU)對腸癌和肝轉移的影響。結果單獨WCA治療降低轉移率(50%vs 100%，P<0.05)。WCA+5-FU聯合治療最有效，轉移率(40%vs 100%，P<0.01)。表明WCA與5-FU聯合治療會顯著抑制結腸腫瘤生長和肝轉移。癌細胞直接種植盲腸，與臨床CRC血道和淋巴播散過程相近;直接縫合比較方便，能夠從整體上觀察CRC成瘤及轉移的情況，該模型是一種研究CRC發展及轉移的可靠、有效的觀察模型;盲腸接種OB醫用膠粘貼，癌組織和腸壁的吻合度較直接縫合先進，應用前景大;盲腸造疝接種法操作簡單，成功率高，受其他臟器及腫瘤細胞影響較小，此法較少縫合到腸壁血管，避免腸壞死以及造成腸瘺等缺點；結腸造口種植模型的實驗動物生存周期較長，觀察時間充裕，但增加了感染的機會，容易影響實驗數據。

1.2 原位直腸種植模型

原位直腸種植模型包括非手術經肛門直腸注射法、肛門切開直腸注射法及肛門直腸癌組織塊種植模型。非手術經肛直腸注射法：麻醉后使實驗動物直腸脫垂，在lO×和100×顯微鏡下將0.1 mL(2.5×104個/mL)的鼠源性腸癌細胞CT26注入距肛門>5 cm(超出肛管近端1～2 mm)的遠端直腸黏膜內，進針深度為黏膜層下約1 mm,避免穿透腸壁。肛門切開直腸黏膜層注射法：用兩個金屬夾夾緊小鼠肛門部直腸的前壁，在金屬夾之間剪開長6～7 mm直腸壁，再將腫瘤細胞懸液注射到直腸黏膜層內。肛門直腸癌組織塊法：主要步驟用縫針輕輕破壞直腸壁，用6/0吸收線縫針把腫塊縫于該處。Wang等[5]采用自制接種器將0.1 mL細胞密度為2×107個/mL的結腸癌細胞HCT116接種于BALB/c裸鼠直腸上，成功建立原位移植性直腸動物模型，直腸原位接種18只成瘤率為100%，未發現肝轉移灶。優點：種植操作簡單，創傷較小,能更好地模擬結直腸癌的臨床生物學行為，比如腫瘤的局部生長、腫瘤的浸潤、癌細胞原位脫落穿過血管壁進入門靜脈循環血運轉移等過程。缺點：直腸壁較薄種植成功率較低，不易操作，遠處轉移少，影響實驗結果。

2 異位種植模型

異位種植模型按植入位置不同可以分為脾臟種植、門靜脈/腸系膜種植、肝臟種植及腹腔擴散種植。

2.1 脾臟種植模型

脾臟種植法是目前CRLM模型公認的最佳模式之一。腫瘤細胞從脾內種植，植入的細胞能避開大量免疫細胞攻擊，通過血管浸潤而發生肝轉移。因此，能較好模擬人體內CRC切除后肝臟轉移。根據是否切除脾臟分為脾臟保留法和脾臟切除法。

2.1.1脾臟保留法：在顯微外科鏡下,于小鼠左側腋后線肋緣下縱行切開長約0.5～1 cm創口，進腹后找到柳葉狀脾臟并牽出腹腔外，用1 mL注射器吸取混懸好的單細胞液0.2～0.5 mL(細胞數約為1×106～1×107個/mL)，從脾下極進針，緩慢注射(約2～3 min)入脾內，注射區可見脾被膜變白隆起。緩慢拔針后酒精棉球按壓針眼,使瘤細胞得經脾靜脈進入肝臟，防止腫瘤外溢。查無出血后依次間斷縫合肌肉、皮膚，關腹。Fleten等[6]通過脾臟注射HT細胞株HT29和HCT116，在裸鼠中建立實驗性肝轉移。注射后，HCT116和HT29細胞在所有動物中產生肝腫瘤。Xu等[7]為了觀察ART1對體內腫瘤生長或肝轉移的影響，成功構建了BALB/c小鼠CT26細胞的脾移植腫瘤模型。優點：操作簡單，易于實施，且保留了脾臟部分免疫功能即保存了宿主固有的抗腫瘤免疫功能。缺點：肝臟轉移瘤形成的同時發生脾臟腫瘤，轉移灶常為散在癌結節，影響小鼠的存活時間，且脾臟腫瘤通常在肝轉移瘤前發生，會影響實驗的準確性，不適于驗證周期較長的藥物實驗。

2.1.2脾臟切除法：脾臟注入腫瘤細胞后，約5～10 min，待注射區蒼白隆起消失后結扎脾血管及胃短動靜脈，切除脾臟，檢查無出血后逐層關腹。Fu 等[8]和Márquez 等[9]將CT-26細胞注入BALB/c小鼠脾囊并切除脾臟，成功建立了CRLM模型。Oshima等[10]建成了一組用熒光素酶和tdTomato穩定標記的HCT116人CRC細胞的單克隆衍生物，并具有不同的生長特性。脾臟注射及脾切除術后，大部分克隆能夠產生肝轉移。該模型提供定量可視化肝臟中個體腫瘤克隆的發展的能力，并估計其生長動力學和定殖效率。優點：更好地模擬了CRC根治術后因血行轉移而發生肝轉移的過程，肝轉移率高，模型穩定，轉移癌向各個肝葉呈彌漫性轉移。可以滿足各種檢測方法的取材需要。缺點:腫瘤分泌降解酶降解細胞外基質，形成偽足，浸潤血管后進入血液等關鍵步驟不能模擬。一定程度上令免疫系統受損，術后動物死亡率高，操作較復雜，對實驗者技術要求較高。主要應用于研究腫瘤形成和分析新的治療效果及宿主免疫機能與癌細胞的關系。

2.1.3半脾模型：半脾模型為脾臟保留和脾臟全切的改良造模方法。Bai等[11]利用裸鼠脾臟特殊解剖結構，建成CRLM半脾模型。用一次性鈦夾夾閉脾臟中央并切斷，分成兩個帶血管蒂的半脾。將HT29細胞接種到近端半脾被膜下，而遠端半脾埋入皮下備治療。一共分6組制模，30 d后觀察肝轉移評分、淋巴結轉移及血性腹水等情況。結果HT29細胞建立的CRLM半脾模型成瘤率為100%。優點:既保留了脾臟的部分免疫功能，又大大降低模型建立時脾臟腫瘤的干擾率。且此模型可以經靜脈給藥，更加貼近于臨床，可應用于CRLM的生物學機制和預防性肝轉移治療的實驗設計及抗腫瘤藥物的篩選。缺點在于動物實驗手術操作相對復雜，對試驗者技術要求極高。

2.2 門靜脈/腸系膜種植模型

門靜脈/腸系膜種植模型是將結直腸癌細胞懸液直接注射入門靜脈/腸系膜靜脈，隨靜脈回流至肝臟后發生轉移。操作要點:取正中切口，使用小的鹽水紗條將腸管放至腹腔左側，顯露門靜脈或者回結腸靜脈，將濃度為1×105～1×107個/mL腫瘤懸液0.1 mL經門靜脈緩慢注入，用棉簽壓迫注射部位數分鐘，防止注射部位出血及癌細胞外滲，造成小鼠死亡或腹腔種植。Bocuk等[12]通過小鼠門靜脈注射CMT-93細胞，成功構建門靜脈小鼠腸癌肝轉移動物模型，肝轉移率約70%～80%。優點：腫瘤轉移速度較快，肝轉移發生率較高，有效模擬腸癌術后肝轉移，適用于腫瘤藥物的篩選。缺點：不能模擬腫瘤轉移全過程，減少原發瘤最初侵襲周圍組織及穿入血管等步驟，且手術操作難度大，手術中死亡率高。

2.3 肝臟種植模型

肝臟種植模型是將CRC細胞直接注射到肝臟中，或者在肝臟表面做一小切口，將大小為2 mm3左右的癌組織植入肝實質內。White等[13]用29號針頭將密度為5×106個/mL CC-531細胞懸液注射入同基因WAG/Rij大鼠中肝葉的囊下，成功建立大鼠CRLM模型,發現24 h內，所有植入細胞的大鼠肝臟都生長腫瘤。優點：腫瘤生長速度快，轉移率高。操作簡單，重復性好。適用于藥物效果的評價。缺點：大部分在注射部位成瘤，周圍很少有轉移衛星結節，不符合臨床上CRLM多發轉移的特點。且只涉及CRC轉移的晚期過程，沒有涉及CRC原位生長的演進過程，與人體內CRC轉移觀察模擬度較差，不適合CRC通過血道及淋巴道為主要轉移途徑的腫瘤模型制作。

2.4 腹腔擴散種植模型

腹腔擴散種植模型是將CRC細胞通過微型注射器直接注射入動物腹腔內，使其播散性生長，引起腹水，解剖后觀察肝臟轉移或其他臟器轉移。若將帶瘤腹水移植到下一代動物，則構建腹水瘤動物模型。Miyoshi等[14]通過將miR-139-5p轉染的Caco-2細胞注射入小鼠腹腔，結果具有較高的肝臟腹膜轉移率，成功建立CRC腹膜轉移小鼠模型。優點:操作簡單，肝臟轉移率高。轉移周期短，短期內可復制大量模型。缺點：沒有專一性器官轉移，僅僅模擬晚期腫瘤患者轉移途徑，對于淋巴轉移及血行轉移意義不大。該模型常用于癌癥晚期腹腔廣泛轉移和CRC術后腹腔種植播散的病理生理研究。

3 源于患者原代腫瘤組織的異種移植(Patient-derived tumor xenograft，PDTX)模型

PDTX模型指在手術期間獲得患者腫瘤組織直接移植或組織經原代培養制成細胞懸液注射到免疫缺陷小鼠來構建。由于該模型能保留原發腫瘤生物學特性，在抗腫瘤藥物機制研究發揮了重要作用[15]。常用于PDTX模型小鼠類型是裸鼠，SCID小鼠，NOD/SCID小鼠和NSG小鼠。最新報道B-NSG小鼠，綜合了NOD-SCID-IL2rg 背景特征，具有重度免疫缺陷表型，與NOD/SCID小鼠相比壽命更長，平均長達1.5 年；對人源細胞和組織幾乎沒有排斥反應；少量細胞即可成瘤，依賴于細胞系或細胞類型；無B淋巴細胞泄漏，B-NSG小鼠是目前國際公認的免疫缺陷程度最高、最適合人源細胞或組織移植的工具小鼠。Bettenworth等[16]使用內窺鏡，在NOD/SCID小鼠結腸黏膜下注射HT-29細胞，注射后12 d發現明顯的腫瘤生長，且肝轉移率28.6%，腹腔轉移率14.3%。Ye等[17]用TLR4 scramble或TLR4 siRNA轉染的SW480細胞通過注射到裸鼠皮下，成功建立裸鼠異種移植模型，肝轉移率較低。Leuci等[18]用患者肝轉移切除術獲得轉移性CRC樣品。處理后并植入2只不同的4至6周齡雌性NOD/SCID小鼠中。腫瘤形成后，傳代并擴增2代，直到產生32只小鼠。成功建立了患者來源的CRLM小鼠腫瘤移植模型，認為PDTX模型可能為預測癌癥進展提供有效的臨床前工具，可用于進一步進行個性化治療的基因組學和藥理學研究。Prall等[19]從手術室收到腸癌新鮮的標本，將小立方體(約3 mm3)從皮下異種移植入NSG小鼠，研究CRC轉移性相關的腫瘤出芽和足底形成。優點：更準確地反映腫瘤生物學，細胞復合物和結構，包括基質細胞，更好地反映了原始腫瘤的特征和遺傳多樣性，可以反映每個患者的特征，有個性化藥物的前景，并且可用于預測對新療法的反應。為臨床前藥效的評估以及生物標志物的鑒定提供了有效的研發資源。已被證明適用于研究轉移和藥物反應[20]。因此，這些模型是測試藥物反應的最佳臨床前模型，特別是難治性癌癥患者。缺點：費用高，建模周期長，且移植率和肝轉移率較低。患者組織中通常存在的壞死區域使移植成功更具挑戰性，缺乏在腫瘤發展和轉移過程中起重要作用的先天和適應性免疫系統。

4 遺傳修飾小鼠模型

遺傳修飾小鼠模型包括兩類：轉基因小鼠模型和基因敲除小鼠模型。轉基因小鼠指通過實驗導入方法將外源目的基因導入小鼠早期胚胎細胞或受精卵，使之與小鼠本身基因組結合，產生攜帶外源目的基因小鼠品系，且可以通過生殖細胞將外源目的基因傳遞給后代。基因敲除又稱基因打靶，指將外源DNA與受體細胞染色體 DNA 上的同源序列之間進行重組，使之整合到預定位點，并代替原有基因，改變細胞遺傳性的方法。遺傳修飾小鼠模型通過基因組表達的改變，提供對整個致癌進展和特定癌癥相關基因的研究機制，可替代PDTX模型，用于了解人類癌癥進展[21]。然而，它們通常不能完全模擬人的遺傳復雜性腫瘤。Roper 等[22]通過CRISPR-Cas9的編輯結腸上皮細胞中Apc和Trp53腫瘤抑制基因并通過原位移植Apc編輯的結腸組織誘導自體腫瘤形成。ApcΔ/Δ;KrasG12D/+;Trp53Δ/Δ (AKP)小鼠結腸組織和人類CRC組織移植到遠端結腸并轉移到肝臟。證實建立的結腸腺瘤中癌基因的順序激活，并重現整個腫瘤進展和轉移。O′Rourke等[23]使用基因工程小鼠模型組織的細胞，原位移植快速構建CRC轉移性小鼠模型。在這個模型中，描述了CRC從腺癌(6周)到局部播散性疾病(11～12周)和自發轉移(>20周)的基因型和時間依賴性進展。因此，該模型提供了快速和靈活的手段用于遺傳和臨床前研究。Atlasi等[24]使用不同的轉基因和基因敲除小鼠模型分析了S100a4在腸腫瘤起始和進展中的體內作用。發現在Apc和Smad4突變小鼠中，S100a4的基因切除或過表達不影響腸道中的腫瘤起始。相反，Apc1638 N/+/KRASV12G小鼠中的S100a4上皮基因過表達增加了腸腫瘤細胞向肝臟的傳播，與其在腫瘤轉移中的作用一致。優點：提供腫瘤發生過程中特異性基因突變影響的信息，與可移植模型相比，該模型更準確地表現腫瘤發展的自然過程和腫瘤細胞與組織微環境之間的相互作用，用于評估腫瘤發生的早期步驟，有望引導CRLM患者進行靶向治療以延長其生命。隨著基因操作技術的不斷開發與改進[25]，遺傳修飾小鼠模型在研究CRC及其轉移發病機理和篩選預防或治療藥物中扮演著越來越重要的角色。缺點：價格昂貴，費力，肝轉移率較低，造模時間長，不利于評估藥物療效，特異性基因的突變可導致胚胎致死性，嚴重的發育缺陷或發生轉移之前的不育。

本文僅概述了結直腸癌肝轉移建模的常用方法，這些動物模型為探究人結直腸癌肝轉移的各種特征提供了一定的方便，筆者認為理想的CRLM模型是具有可預測性和可重復性，能有效地代表人類CRLM微環境，并且能用于驗證患者新的治療方案。目前研究人類CRLM動物模型比較常用且易操作的是種植模型，具有一定研究前景的是PDTX模型和遺傳修飾小鼠模型。