洋蔥細(xì)胞骨架的制作技術(shù)研究*

曹小漢 任莉萍 舒 玉 張金波

（阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 安徽阜陽(yáng) 236037）

細(xì)胞骨架的制備及觀(guān)察是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的重要實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。 細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞胞質(zhì)中存在的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 包括微絲（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）和中間絲（intermediate filament，IF）3 種結(jié)構(gòu)組分［1］。 研究表明，細(xì)胞骨架除了保持細(xì)胞形狀、分隔固定細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和參與構(gòu)成某些細(xì)胞器外，還具有物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳遞、參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分化、增殖，以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)等作用［2-3］。由于細(xì)胞骨架在細(xì)胞生命周期中的重要作用及其與生命活動(dòng)的密切聯(lián)系，細(xì)胞骨架的研究已成為細(xì)胞生物學(xué)乃至生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［4］。在本科生的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，細(xì)胞骨架的制備及顯微觀(guān)察通常是必開(kāi)實(shí)驗(yàn)。 以動(dòng)物離體的成纖維或上皮細(xì)胞作為細(xì)胞骨架制備的常用材料，不僅對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)、保存設(shè)備及試劑要求較高，且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)［5］。而植物細(xì)胞骨架制備取材方便，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備要求不高， 操作簡(jiǎn)單且周期短，是細(xì)胞骨架制備及觀(guān)察的實(shí)用材料。 以新鮮的洋蔥鱗莖為實(shí)驗(yàn)材料， 用適當(dāng)濃度的去垢劑TritonX-100處理細(xì)胞，可溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解，剩下的纖維狀細(xì)胞骨架蛋白比較穩(wěn)定而不被溶解，經(jīng)戊二醛固定和蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)R250 染色后， 可在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察到網(wǎng)狀的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。

由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的相關(guān)步驟對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果都非常重要， 例如實(shí)驗(yàn)材料洋蔥的新鮮程度、TritonX-100 的處理時(shí)間、 戊二醛固定時(shí)間、 考馬斯亮藍(lán)R250 的染色時(shí)間等，所以學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中很難全面掌握每個(gè)環(huán)節(jié)的要領(lǐng)，因此，不易獲得質(zhì)量較高的細(xì)胞骨架裝片， 從而影響觀(guān)察效果。 筆者經(jīng)長(zhǎng)期摸索，總結(jié)了完整且成熟的洋蔥細(xì)胞骨架的制備技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮的洋蔥鱗莖。

1.2 方法

1）采樣。 用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)側(cè)的表皮若干片，每片約1 cm2大小，置于加入6 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）的注射器中（規(guī)格為25 mL），抽真空促使其下沉。

2）TritonX-100 處理。 將下沉的洋蔥鱗莖表皮轉(zhuǎn)移至加入2 mL 1% TritonX-100 的燒杯中 （規(guī)格為50 mL）處理15 min；除去TritonX-100，用M緩沖液洗3 次，每次5 min。

3）固定。 用3%戊二醛固定30 min；除去固定劑，用磷酸鹽緩沖液輕輕清洗3 次，每次5 min。

4)染色。用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染色30 min。

5）制片、鏡檢。 用蒸餾水輕輕沖洗2 次，然后將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。

2 結(jié)果與分析

1）選擇洋蔥時(shí)，用手輕輕按壓洋蔥，選擇包卷度緊密、緊實(shí)度較高的個(gè)體，這樣的材料較為新鮮。

2）用TritonX-100 處理細(xì)胞，抽提15 min 效果較為理想。若處理時(shí)間太短，沒(méi)有抽提掉無(wú)關(guān)蛋白和脂質(zhì)，則細(xì)胞呈很深的背景顏色，看不清細(xì)胞骨架的纖維網(wǎng)絡(luò)；若處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)破壞細(xì)胞骨架，使纖維網(wǎng)絡(luò)斷裂，影響細(xì)胞骨架觀(guān)察。

3）考馬斯亮藍(lán)R250 染色30 min 效果較好。 若染色時(shí)間較短， 則洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架大部分尚未染上色（圖1A，本文附圖見(jiàn)封四）；染色30 min，高倍鏡下可觀(guān)察到細(xì)胞骨架纖細(xì)、連貫性好且可見(jiàn)其廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)，染色效果最佳（見(jiàn)圖1B）；若染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則細(xì)胞背景總體著色較深，難以觀(guān)察細(xì)胞骨架（圖1C）。

3 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞骨架的制備及觀(guān)察是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中較經(jīng)典且重要的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。 多年實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)表明，按照實(shí)驗(yàn)教材常用方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，往往實(shí)驗(yàn)效果不太理想， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果不清晰容易導(dǎo)致學(xué)生對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)理論知識(shí)的理解不夠深入。此外，由于本科生基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課的課時(shí)較為固定， 要求學(xué)生在一次實(shí)驗(yàn)課（約3 學(xué)時(shí)）完成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立完整的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。 因此，通過(guò)對(duì)洋蔥新鮮程度、TritonX-100 的處理時(shí)間、 考馬斯亮藍(lán)R250 的染色時(shí)間等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化， 確保大部分學(xué)生能在既定時(shí)間內(nèi)圓滿(mǎn)完成實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)多次摸索，取新鮮堅(jiān)實(shí)的洋蔥撕取內(nèi)表皮， 用1%TritonX-100處理細(xì)胞，抽提15 min，0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染色30 min， 可快速有效地制備洋蔥細(xì)胞骨架，不僅提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量， 而且為學(xué)生將來(lái)獨(dú)立從事相關(guān)科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。