基于肽生物標志物技術鑒別肉品的真實性研究進展

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(1.國家膠類中藥工程技術研究中心,山東聊城 252201;2.東阿阿膠股份有限公司,山東聊城 252201)

肉制品中含有豐富的優質蛋白和微量元素,其營養價值高且口味獨特,在世界各國的居民食品消費中都占有較大的比重[1]。肉類市場需求的增加和不同物種肉的價格差異,導致了肉品行業摻假盛行,近期最引人關注的便是河北省河間市驢肉摻假事件[2]。肉制品摻假不僅侵犯了消費者的合法權益,而且嚴重沖擊了宗教信仰,另外,使用某些患有傳染病的不合格肉冒充新鮮肉,還可能造成疫病傳播和易感人群的過敏等食品安全問題。

目前,以核酸和蛋白質為基礎的檢測方法已廣泛應用于肉制品的真實性鑒定。基于核酸的檢測方法主要通過聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)技術來實現,包括常規PCR技術[3-4]、限制性片段長度多態性PCR(PCR-RFLP)技術[5-6]、多重PCR技術[7-8]、實時熒光定量PCR技術[9-10]和微滴數字PCR技術[11-12]等;基于蛋白質的檢測方法則主要集中于酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術[13-14]。此兩類肉品真實性鑒定方法,特異性強、靈敏度高且定量準確,但同時也存在著一些弊端。首先,對于加工肉制品而言,核酸和蛋白質在高溫高壓條件下,易發生降解[15]和變性,嚴重影響了定性和定量結果的準確性。其次,對于復雜的肉品基質,PCR反應易受基質效應的干擾[16];而ELISA方法,則無法實現同一反應中多個物種的同時檢測。第三,對于親緣關系較近的物種,ELISA方法易發生物種間的交叉反應[17],產生假陽性結果;而PCR反應則需要反復的引物優化,費事費力。

伴隨著蛋白質組學的發展,以肽生物標志物為基礎的液相色譜-串聯質譜(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術逐漸應用于肉制品的真實性鑒定[18-19]。所謂的肽生物標志物是指具有物種相對特異性的多肽序列,即該多肽序列僅特異性的存在于本物種中,而在研究中的其他物種中不存在。與核酸和蛋白質相比較,多肽序列具有更高的穩定性,能夠耐受高溫高壓和其他嚴峻條件的考驗[20];同時,作為DNA的表達產物,多肽具有更高的組織特異性,能很好的區分開不同物種肉;最后,該方法借助于高靈敏度高掃描速度的LC-MS儀器,可以很容易的實現多個物種的同時檢測,節約時間、提高檢測效率。

本文主要從肉中肽生物標志物的分離鑒定方法、肽生物標志物在鑒定不同肉制品及肉制品中外源蛋白的應用三個方面進行論述,并對肽生物標志物在鑒定肉品真實性應用中的發展方向進行展望,以期為食品溯源提供更豐富的技術手段。

1 肉中肽生物標志物的分離鑒定

1.1 肉中蛋白質和多肽的分離技術

肉中蛋白質含量豐富且種類多樣,采用傳統的蛋白質分離技術如聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、液相色譜等很難將其分離開來,這就給以蛋白質為基礎的肉品真實性鑒定方法帶來了困難和挑戰。伴隨著蛋白質組學的發展和分析儀器的不斷升級,高靈敏度、高掃描速度的質譜技術已開始應用于肉中蛋白質和多肽的分離鑒定,其中應用較多的為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)[18,21]、電噴霧飛行時間質譜(ESI-TOF-MS)[22]、三重四級桿質譜[23-24]和液滴萃取表面分析質譜(Liquid extraction surface analysis mass spectrometry,LESA-MS)[25-26]。

使用質譜技術對肉中的蛋白質和多肽分離主要集中在以下兩種方法。第一種方法為基于特定蛋白質中多肽的分離鑒定,即不同肉制品經蛋白質提取、SDS-PAGE分離和目標蛋白質的切膠酶解等前處理過程,最后使用質譜儀對特定蛋白質的酶解肽段進行分離鑒定,其中應用最多的質譜儀為MALDI-TOF-MS[18,27]。利用該方法可以很容易的實現不同物種肉中單一蛋白質的氨基酸組成分析,進而找出該蛋白的氨基酸序列在不同物種肉中的差異,利用這些差異性的肽段實現對不同物種肉的真實性鑒定[18]。但該方法也存在著樣品前處理復雜,費時費力的缺點。第二種方法為基于全蛋白的多肽分離鑒定,即不同肉制品經蛋白質提取和胰蛋白酶消化兩步處理后,直接進行蛋白質和多肽的分離鑒定[22,28]。該方法無需復雜的蛋白質凝膠分離過程,節省時間和人力[22-24,28];消化后的多肽樣品經一次分離鑒定,就可獲得該物種的絕大多數蛋白質和多肽,與特定蛋白質中的多肽分析相比較,此方法得到的肽生物標志物信息更加豐富可靠。但同時該方法也存在著數據處理繁瑣的缺點。

1.2 肉中蛋白質和多肽的鑒定方法

蛋白質酶解產物經LC-MS電離分析后,將提取到每個肽段的質譜圖,而得知每個肽段的蛋白質種屬來源和氨基酸組成,則需進一步借助蛋白質數據庫進行對比分析。目前,基于數據庫檢索的方式鑒定蛋白質和多肽序列的方法主要有兩種,一是肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint,PMF)技術[19,29],即蛋白質經特異性的酶(通常為胰蛋白酶)酶解后,采用質譜技術對酶解后的多肽混合物進行質量分析,這些特征性多肽的質量就構成了該消化蛋白的肽指紋圖譜。蛋白分析時,將這些肽段的質量與數據庫中所有蛋白質的理論酶切結果相比較,根據得分的高低來實現對未知蛋白的鑒定。PMF的關鍵是準確測量不同肽段的分子質量,但當蛋白質出現翻譯后修飾的現象,會引起肽分子質量的遷移,使PMF的質量數與理論值不相符合,給蛋白質的鑒定帶來困難,這一定程度上限制了該技術的應用。第二種方法為肽碎片離子鑒定法。在串聯質譜的低能量碰撞誘導解離(Collision-induced dissociation,CID)模式下,將待測肽段的峰打碎,通過計算相鄰同類型峰的質量差,同時結合肽段母離子的質量,實現對未知肽段的氨基酸組成分析[30]。但在實際的氨基酸序列解析中,由于不同的碎片可能帶有不同的電荷、肽段的類型不單一或有雜質分子的干擾,都會給氨基酸序列的解析帶來影響。

1.3 肉中肽生物標志物的找尋及確認

LC-MS法鑒別不同肉制品最為關鍵的是:找尋到不同物種肉的特異性肽生物標志物。在肉類摻假鑒定中,所謂的特異性肽生物標志物是指:該多肽序列僅特異性的存在于本物種中,而在研究中的其他物種中不存在,且該肽段所對應的蛋白質為高豐度蛋白[22,31]。目前,主要通過數據庫檢索的方式,實現潛在肽生物標志物的找尋。在利用數據庫找尋目標物種的潛在肽生物標志物時,首先應找出在所有研究物種中同時存在的蛋白質,之后比較該蛋白在不同物種中的氨基酸組成,最后找出僅在目標物種中存在的特異性肽段,這些特異性肽段就為目標物種的潛在肽生物標志物。通過數據庫檢索到的潛在肽生物標志物,可能會由于數據庫的缺失或物種親緣關系較近,而產生假陽性的結果,因此有必要對潛在肽生物標志物進行實際物種測試,以進一步確認其特異性。

伴隨著質譜儀器的發展,四級桿質譜的多反應監控(Multiple-reaction monitoring,MRM)掃描模式已成功運用于肽生物標志物的特異性分析。MRM是基于肽的已知或者假定信息,有針對性的獲取質譜數據的一種技術。具體地,MRM是根據多肽的母離子和子離子的質量數信息,構建出該肽的母離子/子離子對,符合要求的母離子進入碰撞室,碰撞打碎后,在二級掃描中記錄子離子信號,通過母離子和子離子的前后兩次選擇,可以有效的排除干擾,提高方法的特異性和靈敏度[32]。

MRM確認肽生物標志物的特異性具有很多優勢。首先,準確度高;MRM實現了對特定肽段的多個母離子/子離子對的雙重選擇鑒定,特異性強,準確度高。其次,結果容易觀察;判斷肽生物標志物的特異性,只需觀察該肽在不同物種中的MRM峰保留時間,無需其它繁雜的數據處理。第三,快速高效;根據不同肽段的出峰時間,可以實現一次進樣數百個肽段的同時分析鑒定。此外,MRM方法除了可以確認肽生物標志物的特異性外,還可以實現蛋白質組學中的定量分析[33]。

2 肽生物標志物在鑒定不同肉制品中的應用

蛋白質作為DNA的表達產物,與DNA相比較,蛋白質具有更高的組織特異性,而DNA 在同一個體不同組織之間沒有差異[34],同時,多肽鏈的氨基酸組成作為蛋白質的基本結構,具有很高的特異性和穩定性,能很好的耐受外界環境(高溫、高壓和酸堿度)的干擾。伴隨著蛋白質組學的興起,以特異性肽生物標志物為基礎的LC-MS方法逐漸用于肉制品的真實性鑒定[35]。

Taylor等[36]首次采用質譜技術,對來自不同物種中的血紅蛋白和肌紅蛋白進行了分析比較,并提出了該技術可以潛在的應用于不同物種肉的鑒定。2010年,Sentandreu等[18]提出了一種基于蛋白質組學的方法,檢測混合肉中的雞肉成分;首先使用LC-MS技術對雞肉中的肌球蛋白輕鏈3酶解產物進行分析鑒定,之后分別繪制不同比例雞肉含量的混合肉與雞的肽生物標志物豐度之間的標準曲線,并以此來進行混合肉的定量分析,結果顯示該方法可以檢測出豬肉中0.5%的雞肉含量。伴隨著2013年歐洲“馬肉丑聞”的曝光以及PCR技術在檢測加工肉制品中的缺陷,越來越多的研究集中于利用肽生物標志物技術檢測肉制品中的馬肉[22,27]和清真肉[28,37]成分。液滴萃取表面分析質譜(LESA-MS)作為一種新的分析技術,也已開始應用于肉制品的真實性鑒定中[25-26,38],且有報道該方法比傳統的電噴霧質譜(ESI-MS)技術有更高的靈敏度和穩定性[25]。國內,以肽生物標志物技術檢測肉制品的真實性研究起步較晚,李瑩瑩等[39]利用蛋白質組學的方法找尋出羊肉和鴨肉的特異性多肽,并分別選擇兩種肉響應較好的5條特異性多肽進行定量分析,結果表明,該方法可以檢測出羊肉中0.5%的鴨肉含量。張穎穎等[40]建立了一種定量牛肉中豬肉和雞肉成分的LC-MS方法,首先采用高分辨率質譜分別找出牛肉、豬肉和雞肉的潛在肽生物標志物,之后采用質譜MRM模式,對潛在肽生物標志物進行特異性確認,最后分別選擇3種肉的3組特異性肽進行定量分析,結果顯示,該方法與較常用的PCR方法檢測結果相一致,定量限達到0.5%,特異性強準確度高。除用廉價的肉代替高昂的肉制品摻假外,在肉中添加其他外源性蛋白也是肉制品摻假的一種常見方式,接下來對以肽生物標志物技術檢測肉制品中的外源性蛋白成分進行綜述。

3 肽生物標志物在鑒定肉制品中外源蛋白的應用

外源蛋白質的添加可以明顯改善肉制品的功能性質,例如增加肉的持水性和改進肉的組織結構等[41],同時,外源蛋白質的添加也降低了肉制品的加工成本,給一些不法分子帶來可乘之機。現在,一些國家的法律法規已明確禁止或限制在肉類加工過程中蛋白質的添加量,因此,有必要開發一種強有力的分析技術來控制這種欺詐行為。肽生物標志物技術作為一種有效的分析方法,已開始應用于肉制品中外源蛋白的分析檢測。

Leitner等[42]開發了一種以蛋白質和多肽為標志物的方法,鑒定加工肉制品中的大豆蛋白成分,包括大豆分離蛋白的提取和預分離、胰蛋白酶的消化以及LC-MS的分離鑒定,結果表明,該方法能很好地區分肉制品中的大豆蛋白成分,且可以用于定量分析。Hoffmann等[43]建立了一種同時檢測肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆成分的LC-MS方法,樣品經蛋白質提取、胰蛋白酶消化和LC-MS分析鑒定后,每種豆類分別選取3～4個肽生物標志物進行定量分析,結果表明,該方法可以最低檢測到肉制品中2、5和4 mg/kg的羽扇豆、豌豆和大豆成分,方法特異性高,無交叉污染。

外源蛋白的添加除降低加工成本外,還可能會引起易感人群的過敏癥狀[44],利用肽生物標志物技術找尋不同食品中的過敏原也是蛋白質組學的一個研究方向。Heick等[45]開發了一種同時檢測不同食物中七種過敏原的LC-MS方法,檢測結果與市售ELISA試劑盒分析結果相比較,兩者無顯著性差異。Montowska等[46]利用LC-QTOF-MS技術開發了一種檢測禽肉制品中非肉類蛋白成分的方法,利用該方法可以檢測到加工禽肉制品中關于大豆、牛奶和蛋清蛋白中的43個、9個和12個熱穩定性肽生物標志物,且這些多肽所對應的蛋白多為致敏性蛋白。

4 肽生物標志物在鑒定肉品真實性應用中的發展方向

檢測速度是評價檢測方法優劣的一項重要指標,以肽生物標志物為基礎的肉品真實性鑒定方法的檢測速度,很大程度上依賴于蛋白質的消化速率。在目前的相關研究中,為了獲得最大的蛋白質覆蓋率,提取到的肉類蛋白質通常在胰蛋白酶消化液中,37 ℃條件下反應12 h,此過程是耗時的,很難適應肉制品的快速定性和定量分析。此前已有報道,通過微波[47]、高壓[48]和超聲[49]的方式可加速胰蛋白酶的消化過程,Carrera等[50]利用高強度聚焦超聲的方式輔助胰蛋白酶的消化,成功用于不同魚類物種的分析鑒定,且整個消化過程只有2 min。消化時間的縮短可最大限度的減少樣品前處理時間,后續僅需約20 min的LC-MS采集時間即可完成對肉品真實性的認證,檢測時間遠短于傳統的熒光定量PCR方法。

肽生物標志物的特異性關系到整個LC-MS方法的準確度。伴隨著蛋白質組學的發展和質譜儀器的更新換代,新一代的MRM3掃描在定量分析中表現出獨特的優勢,該技術能很好的降低背景噪音,消除非目標峰的干擾,提高定量結果的靈敏度,目前,該技術已在von Bargen[22-23]的研究中得到嘗試。此外,平行反應監測(Parallel reaction monitoring,PRM)作為MRM的升級技術,能夠實現對目標蛋白質和肽段的選擇性檢測,從而實現對目標蛋白質或肽段的絕對定量分析。

5 結語

肽生物標志物技術作為一種新興的肉品真實性鑒定手段,其特異性、靈敏度和準確性都能與傳統的PCR方法相媲美。除此之外,該技術還存在著穩定性強和快速高效的特點,這就使得該方法對大量的、復雜的和不同加工程度的肉制品分析更有優勢。該方法的提出,不僅豐富了肉品真實性鑒定手段,打擊了不法犯罪,而且對整個食品行業的溯源工程也起到了積極的推動作用。

同時,作為一種行之有效且非常有前途的分析方法,肽生物標志物技術在今后的肉制品真實性鑒定方面具有以下發展趨勢:不斷優化樣品前處理過程,提高檢測方法的重復性;縮短全過程檢測時間,提高檢測速率;伴隨分析儀器的更新換代,提高檢測方法的特異性和靈敏度。

總之,伴隨著樣品前處理方法的改進和蛋白質組學的日漸成熟,以肽生物標志物為基礎的LC-MS技術在物種的認證和檢測肉制品的真實性方面有著廣闊的發展空間。