液相色譜串聯質譜法同時測定漿果類、瓜果類水果中19種植物生長調節劑的殘留量

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(蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅蘭州 730000)

植物生長調節劑(plant growth regulator,PGR)是人工合成的激素類化合物,屬于農藥,對農作物的生長起到增產、催熟、增色等作用,但具有一定的毒性[1-3]。近年來,隨著科技的發展以及人們對水果的質和量需求的增長,濫用及盲目改變植物生長調節劑的使用劑量常有發生,影響到果蔬的食用安全,由此導致的食品安全問題備受關注[3-4,15-17]。

國內現有的檢驗標準只有針對單一生長調節劑的且主要對象為出口食品,國內外已有研究多種生長調節劑的氣相色譜法、液相色譜法、酶聯免疫法、氣質聯用法、液質聯用法[3,5-14],其中液相色譜-質譜法為熱點方法,解決了雜質的干擾、靈敏度低等問題,但針對生長調節劑使用較頻繁的漿果、瓜果類的專屬檢測方法未見報道。

本實驗前期進行了田間及農藥使用的實地考察,將葡萄、草莓、西瓜等水果中使用的PGR范圍縮減為矮壯素、縮節胺(甲哌鎓)、脫落酸(S-誘抗素)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、胺鮮酯(DA-6)、吲哚乙酸、赤霉素、5-硝基愈創木酚、氯吡脲、吲哚丁酸、1-萘乙酸(1-萘乙酸鈉)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、4-氯苯氧乙酸、蕓苔素內酯(油菜素內酯)、四烯雌酮、多效唑、烯效唑、調節膦(安果),針對以上生長調節劑,本文詳細對其前處理、儀器方法等進行了研究,選用HPLC-MS/MS建立了測定方法,旨在為生長調節劑的標準建立提供理論基礎,為生長調節劑的應急檢測及風險監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吲哚乙酸、吲哚丁酸、1-萘乙酸、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、四烯雌酮、氯吡脲、多效唑、矮壯素、烯效唑、噻苯隆、調節膦、縮節胺/甲哌鎓、5-硝基愈創木酚鈉、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素、4-氯苯氧乙酸 來源為Dr.Ehrenstorfer.Gmbh;脫落酸、蕓苔素內酯/油菜素內酯 上海安譜科技有限公司;胺鮮酯 北京曼哈格,以上對照品純度均大于96%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸 均為色譜純,德國Merck公司;乙酸銨 HPLC級,美國Sigma公司;封端十八烷基(C18)粉末、N-丙基乙二胺(PSA)粉末、石墨化炭黑(GCB)粉末、增強基質去除(EMR)粉末 美國Agilent公司;無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸氫二鈉、檸檬酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;超純水 由超純水系統制備。

6460三重四級桿液質聯用儀,配有1260HPLC 美國Agilent公司;5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Milli Q超純水系統 美國Millipore公司;B-400均質儀 美國BUCHI公司;EVA50A氮吹儀 普立泰科公司;MS3 渦旋混勻器 美國IKA公司;十萬分之一、萬分之一電子天平 德國Sartorius公司;KS 501振蕩器 美國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 提取:準確稱取粉碎均勻的樣品5 g,加入10.0 mL 1%乙酸乙腈溶液,振蕩(300 Mot/min)15 min,以提高提取率,然后加入脫水試劑(含4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸氫二鈉、0. 5g檸檬酸鈉),立即渦旋混合1 min,在4 ℃、4000 r/min離心5 min,使得乙腈和水相完全分離。取5.0 mL上清液用于凈化。

凈化:加入裝有填料的凈化管中,渦旋振蕩2 min,于4 ℃、10000 r/min離心5 min,取上清液2.0 mL氮吹至凈干,用50%的甲醇水溶液復溶至1.0 mL后,過0.2 μm濾膜過濾后,上機測定。對比凈化填料的不同組成及配比,以各目標物的回收率為評價指標,凈化填料組成及配比的方案見表1。

表1 凈化填料的組成及配比Table 1 Composition and proportion of purifying filler

1.2.2 液相色譜條件 液相色譜的流動相比較了a. 乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸銨溶液三種組成,通過各目標物色譜峰面積大小確定最佳流動相組成。

色譜柱:Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。流動相A:0.1%甲酸水,流動相B:乙腈;梯度洗脫程序如下表2。流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:5 μL。

表2 流動相梯度條件Table 2 Gradient elution condition for liquid phase

1.2.3 液相色譜-串聯質譜條件 采用濃度0.1～0.5 μg/mL的目標物單元素標準溶液進行質譜條件的確定,分別通過自動軟件優化、手動優化兩種方法。

液相色譜-串聯質譜條件:ESI源,多反應監測模式(MRM),噴嘴電壓:30 psi,干燥氣溫度:350 ℃,干燥氣流速:13 L/min,毛細管電壓:4000 V。各生長調節劑的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓參數見表3。

表3 生長調節劑的質譜條件Table 3 Mass spectrometric parameters of the growth regulators

1.2.4 方法學驗證 用空白葡萄基質配制混合標準溶液系列,以化合物濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標做標準曲線。將標準曲線最低濃度的混標溶液取1.0 mL,加入陰性葡萄樣品中,按1.2.1方法進行加標實驗,得到目標化合物的濃度與3倍信噪比(S/N)比較,調整各目標化合物的加標量,得到各目標物響應為3倍信噪比(S/N)時對應的樣品濃度,由此得到各目標物的方法檢出限,以目標化合物響應為10倍信噪比(S/N)時對應的樣品濃度計算各化合物的定量限。

分別取葡萄、草莓、西瓜的空白基質,添加40.0、100.0、200.0 μg/kg三個水平的19種生長調節劑混合標準溶液,批內6次平行,按1.2.1方法進行添加回收實驗。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

采用19種生長調節劑的單元素標準溶液(濃度低會影響碎片離子的判斷)進行質譜條件的確定,分別通過自動軟件優化、手動優化兩種方法。實驗得出:使用軟件自動優化時,縮節胺、4-氯苯氧乙酸、2,4-D僅有1對碎片離子,手動優化可找到定性離子;1-萘乙酸(鈉)僅有1對碎片離子。其次,6-BA、噻苯隆、氯吡脲、吲哚乙酸、吲哚丁酸、脫落酸在正、負離子模式下均有響應,但是在正離子模式下豐度明顯較高,因此赤霉素、2,4-D、5-硝基愈創木酚、4-氯苯氧乙酸為負離子模式,其它目標物均為正離子模式。

2.2 液相色譜條件優化

2.2.1 流動相的選擇 流動相比較了:a.乙腈-水、b.乙腈-0.1%甲酸水溶液、c.乙腈-5 mmol乙酸銨溶液,當流動相為b、c時,二者對各目標物的峰形及響應影響不大,優選不含鹽的弱洗脫相0.1%甲酸水溶液。比較a、c兩種流動相,對目標物的峰形、分離度沒有影響;對保留時間有較小的影響:a條件下矮壯素、縮節胺、6-BA、胺鮮酯保留時間延后;對各目標物的響應(以峰面積表示)影響較大,a、b條件下各生長調節劑的峰面積對比見圖1(取5次測定的平均值為結果)。由圖1可知,水作為弱洗脫相時,赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、油菜素內酯無響應;吲哚丁酸、調節膦的響應不受影響,其它目標物的響應均在水作為弱洗脫相時較高,且5-硝基創愈木酚在乙腈-水條件下的響應較乙腈-0.1%甲酸水溶液條件下高25倍。除赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸(均為負離子模式),其它16種生長調節劑在流動相(水和乙腈)下響應較高。綜合考慮,19種生長調節劑的流動相為:0.1%甲酸水溶液和乙腈。

圖1 不同流動相組成對生長調節劑峰面積的影響Fig.1 Effects of different mobile phase compositions on growth regulator peak area

2.2.2 流動相梯度條件的確定 色譜柱及流動相的梯度條件對多目標組分的分離有較大影響。本文比較了Waters Acquity HSS T3色譜柱、Agilent Eclipse Plus C8 RRHD色譜柱、Agilent XDB-C18色譜柱,在Waters Acquity HSS T3色譜柱條件下,目標物的分離度、峰形和靈敏度都較好。試驗發現,流動相起始的比例對目標物的分離有較大的影響,圖2為三種梯度條件下19種生長調節劑的總離子流圖。由圖2可知,A(起始比例為0.1%甲酸水97%)和B(起始比例為乙腈90%)條件下,所有目標物出峰時間重疊,影響峰形,且無法分段采集,導致目標物響應降低。當水相起始比例為30%時,各化合物在11 min內依次分離(見圖2中C)。泵壓在17 min時達到平衡。因此,本實驗色譜柱確定為Waters Acquity HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm),流動相的梯度條件如表2所示。19種植物生長調節劑混合標準溶液的MRM色譜圖見圖3。

圖3 19種生長調節劑的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of the 19 plant growth regulators

圖2 不同梯度條件的流動相對生長調節劑出峰的影響Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the growth regulator注:圖A～C流動相起始比例分別為：0.1甲酸水∶乙腈=97%∶3%、90%∶10%、70%∶30%。

2.3 標準溶液稀釋溶劑的確定

對照品均易溶于甲醇,用甲醇配制一級儲備液(1 mg/mL)。混合標準溶液的配制溶劑對目標物出峰有影響。比較不同(甲醇+水)溶液的濃度:100%、70%、50%、20%、0%,對各目標物響應的影響見圖4。由圖4可知,調節膦在甲醇+水濃度為50%～20%時響應較好,使用100%甲醇在色譜柱中不保留,無響應;胺鮮酯、脫落酸受配制溶液濃度的影響較大,隨著甲醇-水溶液濃度降低,響應降低;赤霉素在70%的甲醇+水溶液中的響應較50%的小;其它生長調節劑的響應受配制溶液濃度的影響較小。綜合考慮,當甲醇+水的比例為50%時,各化合物均能保證較好的響應值,因此選擇50%的甲醇+水為對照溶液及樣品上機前的復溶溶液。

圖4 不同濃度的標準溶液稀釋溶劑對19種生長調節劑峰面積的影響Fig.4 Effects of different concentrations of standard solution on the peak area of 19 growth regulators

2.4 樣品提取溶劑的優化

乙腈極性大,對農藥殘留的提取有較好的效果,且考慮到甲醇的危害性,所以提取溶劑以乙腈為主,在其他前處理條件不變的方法下,選取不同的提取溶劑:乙腈、70%乙腈水溶液、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈,通過比較回收率確定樣品的提取溶劑。19種生長調節劑在不同提取溶劑的回收率對比見圖5。由圖5可知,乙腈或1%乙酸乙腈提取效果較好,均在70%～110%之間,而70%乙腈水溶液、1%甲酸乙腈對多組分的提取效果不均衡,吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸的回收率較低;乙腈和1%乙酸乙腈提取條件下的平均回收率分別為81.3%和87.0%,綜合考慮選用1%乙酸乙腈為提取溶劑。因為酸性條件抑制了植物生長調節劑中羧酸的電離,從而增加其在乙腈中的溶解度[18]。漿果類、瓜果類水果的水分含量為85%～90%,用1%乙酸乙腈提取時,形成酸化乙腈水的體系,對不同極性的目標物有較好的提取率。因此,本實驗選擇用1%乙酸乙腈為提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對19種生長調節劑回收率的影響Fig.5 Effects of different solvent on recovery of 19 growth regulators

2.5 凈化條件的優化

蔬菜水果中的農藥殘留凈化過程主要使用PSA、GCB、C18、EMR。本試驗選取了以上5種方案(表1),通過回收率確定凈化的填料及配比,5種凈化方案對生長調節劑回收率的影響見圖6。PSA可去除樣品中的有機酸、糖等干擾物,對4-氯苯氧乙酸、2,4-D有一定的吸附,但與PSA的使用量有關,方案3、4中PSA僅為100 mg,由圖6可知,對目標物的回收率影響不大。C18在方案1、2中為150 mg,此使用量對6-BA、矮壯素的回收率有降低的影響;當GCB的使用量從15 mg升至30 mg時,對6-BA、矮壯素的回收率有降低的影響。19種生長調節劑回收率在70%～110%之間的為方案3,且方案3去除漿果類的花色苷效果最佳,因此選方案3為本實驗的凈化填料及配比。

圖6 不同凈化條件對19種生長調節劑回收率的影響Fig.6 Effects of different purification conditions on recovery rate of 19 growth regulators

2.6 基質效應、線性范圍、檢出限及定量限

不同的樣品基質對目標物的響應值會有增強或抑制的作用,為基質效應。本試驗分別比較了葡萄、草莓、西瓜的空白基質配制的混合標準溶液和50%甲醇水溶液配制的混合標準溶液,通過基質標樣的響應值/純溶劑標樣的響應值,得到78%的目標物的基質效應值小于1,即表現為基質抑制作用。因此使用空白樣品基質配制混合標準系列溶液。

用空白葡萄基質配制混合標準溶液的系列,以濃度為橫坐標,色譜峰峰面積為縱坐標,進行一次線性回歸計算,標準曲線的相關系數(r)均大于0.9902。由1.2.4方法得到方法檢出限和定量限,檢出限為0.09～16.8 μg/kg,定量限為0.27～50.4 μg/kg,具體見表4。

表4 19種生長調節劑的標準曲線、線性范圍、檢出限及定量限Table 4 Standard curves,correlation coefficients,LODs and LOQs for 19 growth regulators

2.7 不同基質的回收率和精密度

分別取葡萄、草莓、西瓜的空白基質,添加低、中、高三個水平的19種生長調節劑混合標準溶液,進行前處理,測定回收率,每個水平均測定6次,計算RSD,結果見表5,19種生長調節劑的回收率為69.4%～106.2%,RSD為1.1%～12.5%。

表5 不同基質中19種生長調節劑的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 5 Average recoveries and RSDs of 19 growth regulators in diffient matrix(n=6)

續表

2.8 實際樣品的測定結果

隨機購買市售漿果類、瓜果類水果200種,檢出率為6.3%,其中葡萄、櫻桃、草莓、獼猴桃中的分別檢出矮壯素、氯吡脲、赤霉素、5-硝基愈創木酚鈉、脫落酸,最大濃度分別為30.45±0.11、1.22±0.01、18.41±0.04、2.03±0.01、8.97±0.02 μg/kg,西瓜、香瓜中僅在西瓜中檢出氯吡脲,濃度為(2.86±0.01) μg/kg，其中檢出胺鮮酯的樣品和空白樣品的總離子流圖見圖7。對于果蔬類中殘留的生長調節劑對人體的危害需進一步通過實驗驗證。

圖7 檢出胺鮮酯的樣品和空白樣品的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagrams of samples and blank samples were obtained

3 結論

本實驗建立了同時測定漿果類、瓜果類水果中19種植物生長調節劑的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)-(PSA)分散固相萃取凈化。液相色譜采用Waters Acquity HSS T3色譜柱,乙腈和 0.1%甲酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質譜分析采用電噴霧多反應監測模式,以基質匹配標準曲線外標法定量。19種植物生長調節劑在各自濃度范圍內線性良好,線性相關系數(r)均大于 0.9902,檢出限為0.09～16.8 μg/kg,定量限為0.27～50.4 μg/kg。以葡萄、草莓、西瓜為代表性基質進行三水平加標回收實驗,回收率為69.4%～106.2%,相對標準偏差(RSD)在1.1%～12.5%之間。本方法簡便快速,靈敏度和準確性高,應用于日常檢測可以縮短檢測周期,降低檢測成本,對植物生長調節劑殘留檢測具有重要意義。