谷氨酸棒狀桿菌高效發酵谷氨酸的關鍵分子機理研究進展

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(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050;2.中國科學院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

谷氨酸是食物蛋白質的重要組成,在營養代謝、能量供應、免疫響應、氧化應激及信號通路調節等過程中發揮重要作用[1]。因此,谷氨酸作為一種重要氨基酸被廣泛應用于食品、飼料、醫藥、化妝品等行業。谷氨酸是由α-酮戊二酸與游離氨在谷氨酸脫氫酶的催化下發生還原氨基化而形成。已經證實大腸桿菌突變菌株(E.coli)及芽孢桿菌屬(Bacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)中有許多菌株能生產谷氨酸,其中谷氨酸棒狀桿菌是研究和應用最多的谷氨酸生產菌[2]。

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種好氧型的、非致病革蘭氏陽性菌,它是一種重要的工業微生物,用來發酵生產 L-谷氨酸,其它氨基酸及各種有機酸[2]。谷氨酸產生菌大多為生物素缺陷型,因此在谷氨酸發酵時通過控制生物素亞適量,引起代謝失調,使谷氨酸得以積累[3]。在利用木質纖維素水解產物作為原料發酵生產谷氨酸時(如稻草、小麥秸稈、甘蔗渣),需要克服過量生物素對谷氨酸分泌產生的抑制作用,在發酵過程中適時適量添加吐溫40(Tween 40)或青霉素等誘導物可有效提高谷氨酸產量[4]。谷氨酸合成途徑包含大量復雜的酶反應,包括糖酵解途徑(glycolytic pathway,EMP)、磷酸己糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)、三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA)、乙醛酸循環(glyoxylic acid cycle,GAC)、伍德-沃克曼(Wood-Werkman cycle)反應等。由于谷氨酸合成分解代謝途徑比較復雜,影響其合成和分解代謝的因素也會較多,對谷氨酸合成機理的研究造成了一定困難,一直以來在其合成代謝途徑中的酶、基因等許多因素的作用和功能不明確。

近年來隨著分子生物學的快速發展,分子生物學技術在谷氨酸研究領域的應用越來越廣泛,大量合成谷氨酸的新機理被不斷揭示,包括誘導物觸發谷氨酸的分泌都伴同α-酮戊二酸脫氫酶復合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC)酶活的顯著降低與細胞膜通透性的增加,從而引起代謝流的方向變化并激活谷氨酸運輸蛋白,最終影響谷氨酸的合成。本文綜述了近年來有關谷氨酸合成與分泌機理的研究進展,以期對未來開發微生物合成谷氨酸及其它生物產品提供參考和方向。

1 轉錄水平調控谷氨酸積累

1.1 中心代謝途徑相關酶轉錄水平

合成谷氨酸的代謝途徑至少有16步酶促反應,其中任意一個酶轉錄水平的變化都可能引起代謝流走向的改變,影響谷氨酸的合成。Hirasawa等[5]利用代謝組學和轉錄組學技術研究發現,在發酵途中添加青霉素后,10～360 min細胞內含有的20種氨基酸的含量均下降,有四個可能與谷氨酸分泌相關的信號轉導基因轉錄水平上調,戊糖磷酸途徑相關基因轉錄水平下調,三羧酸循環與糖酵解途徑中有關葡萄糖轉化為α-酮戊二酸的基因轉錄水平上調,α-酮戊二酸轉化為草酰乙酸的基因與補給途徑相關基因轉錄水平下調。此外,NCgl1221與odhI分別編碼谷氨酸運輸蛋白與ODHC抑制蛋白,它們的轉錄水平上調。這些實驗結果表明青霉素引起的細胞代謝變化和谷氨酸的分泌,是代謝途徑中相關酶的轉錄水平改變觸發的。曹艷[6]通過關鍵酶的轉錄水平分析,進一步闡明轉錄水平與谷氨酸大量積累的內在關系,生物素充足時,添加Tween 40能夠提高胞內催化所有的代謝途徑關鍵酶的轉錄水平,并誘導了細胞轉型使細胞膜(壁)結構發生改變、通透性增加。胞內谷氨酸含量升高,運輸蛋白的轉錄水平也大幅提高促使谷氨酸分泌,最終使發酵液中谷氨酸濃度達到正常水平。Kataoka等[7]通過DNA芯片技術研究發現,生物素限量、初始生物素過量在發酵途中添加青霉素或Tween 40,可以降低α-酮戊二酸脫氫酶復合物的活性,從而改變代謝流的流向使谷氨酸大量合成,該酶由α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate decarboxylase,E1)、二氫硫辛酰轉琥珀酰酶(dihydrolipoamide succinyltransferase,E2)和二氫硫辛酰脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,E3)三種酶組成。α-酮戊二酸脫氫酶復合物酶活性降低是由編碼E1的基因odhA和E2的基因sucB轉錄水平下調所致。此外,還有5個目前未知功能的可能與谷氨酸大量合成相關的基因顯著上調(NCgl0917、NCgl2944、NCgl2945、NCgl2946和NCgl2975),涉及EMP、PPP和TCA途徑的大多數基因下調,這些結果表明,谷氨酸的大量產生與細胞中已有的酶密切相關。

1.2 能量代謝及分支菌酸缺失株基因轉錄水平

細胞內能量水平對糖代謝相關酶、ATP依賴型的運輸系統有調控作用,因此,能量代謝可能會影響谷氨酸的合成與積累。Sekine等[8]發現一株帶有自發新霉素突變的谷氨酸棒狀桿菌,對葡萄糖的消耗比率較親本菌株高2倍,但其生長率比親本菌株低,且H+-ATPase 活性降低了25%。進一步研究發現,在H+-ATPase 的γ亞基基因序列中有一個點突變。后經發酵條件優化,該菌株的谷氨酸產量提高一倍以上[9]。利用H+-ATPase基因失活構建高產谷氨酸基因工程菌,證實了H+-ATPase基因失活對提高谷氨酸產量的作用[10]。Hirasawa等[5]在轉錄組測序的基礎上,通過差異基因功能富集分析,發現青霉素誘導谷氨酸分泌時與能量合成、轉換的相關基因轉錄水平顯著下調,編碼F1F0-ATPase的基因轉錄水平下調。以上結果表明,谷氨酸的大量分泌可能與細胞內能量合成與轉化的基因轉錄水平下調有關系。

細胞壁對氨基酸的分泌具有滲透屏障的作用,同時分枝菌酸是谷氨酸棒狀桿菌細胞壁非常重要的組分。為了探究分枝菌酸的功能和分支菌酸缺失對細胞造成的影響,高云飛[11]構建了C.glutamicumATCC13869的分枝菌酸缺失株,發現其合成和分泌谷氨酸的能力顯著提高;隨后通過轉錄組對比分析分枝菌酸缺失株和原始株,共獲得2692個差異表達基因,這些基因涉及細胞壁代謝、磷脂合成、脂肪酸合成與分解、肌醇代謝、細胞分裂、RNA降解等。因此,分枝菌酸可以作為潛在的改造靶點提高谷氨酸產量,同時說明分枝菌酸的缺失還對細胞的多方面造成了影響。

轉錄水平在促進谷氨酸生產過程中起重要作用,優化中心代謝途徑,抑制ODHC活力,使α-酮戊二酸氧化能力降低,還參與細胞表面結構的改變,使細胞膜的滲透性增強,提高轉運蛋白表達量,最終誘導谷氨酸的高產。

2 關鍵酶酶活調控谷氨酸的合成

2.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活調控

谷氨酸上游代謝途徑的中間產物檸檬酸,是三羧酸循環起始步驟中的草酰乙酸與乙酰-CoA通過碳原子之間的相互縮合而形成。因此這兩種化合物的平衡供應對谷氨酸的高效生產非常重要。谷氨酸棒狀桿菌存在兩條回補途徑分別是:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenopyuvate carboxylase,PEPC)催化烯醇式丙酮酸轉化為草酰乙酸(oxaloacetic acid,OAA)和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)催化丙酮酸轉化為OAA。Tomokazu等在谷氨酸發酵過程中添加Tween 40后,發現發酵液開始大量積累谷氨酸,此時PC催化反應途徑的流量顯著提高,PC活性顯著升高[12]。因此,在Tween 40誘導谷氨酸生產中,PC催化的反應途徑對谷氨酸合成至關重要。生物素限量誘導谷氨酸分泌時敲除PEPC的編碼基因ppc會使谷氨酸棒狀桿菌失去產生谷氨酸的能力,而敲除PC的編碼基因pyc則不影響谷氨酸的合成。13C標記的代謝流分析發現pyc敲除后補給途徑流量低于野生型,而過表達ppc則會提高pyc敲除和野生型補給途徑的流量。因此,在生物素限量誘導谷氨酸生產中,PEPC催化的反應途徑是合成谷氨酸的必要途徑[13]。

PEPC是調節酶受產物和代謝中間物的反饋阻遏與反饋抑制(如谷氨酸、天冬氨酸、2-酮戊二酸、蘋果酸),解除反饋作用能夠增加補給途徑對OAA的補充[14-15]。PEPC中的單個氨基酸替換(D299N)能夠解除天冬氨酸對PEPC的抑制,使PEPC酶活提高,從而促進谷氨酸合成[16]。敲除丙酮酸激酶基因(pyruvate kinase,PYK)后細胞糖耗加快而生長率降低,PEPC酶活提高而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶酶活下降,同樣有助于谷氨酸的合成[17]。此外,在谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中敲除pyk并解除天冬氨酸對PEPC的反饋抑制,能協同提高谷氨酸的產量[18]。Mizuno等[19]發現谷氨酸大量合成時涉及EMP、TCA及其他代謝途徑的相關酶的琥珀?；潭让黠@升高,而乙?；潭让黠@降低,這可能是因為代謝物能夠調控酶的酰化狀態,使受到酰化修飾的酶的活性發生變化,從而調節谷氨酸合成。在Tween 40誘導的條件下,谷氨酸棒狀桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中有八個賴氨酸殘基發生乙?；蜱牾；揎?Nagano等[20]發現PEPC中K653殘基的乙酰化修飾對谷氨酸合成至關重要。K653的乙?；构劝彼岱置谒矫黠@降低(1 g/L),而非乙?；咏７置谒?15 g/L),對PEPC的催化效率指數(kcat/Km)進行測定,發現乙?；蟮腜EPC催化效率指數比野生型降低了90倍,這表明K653的乙?；诤艽蟪潭壬辖档土薖EPC的活性。NCgl0616編碼的一種去乙?；?可以激活PEPC,其可能在谷氨酸合成過程中起激活PEPC的作用。這是因為PEPC受到細胞內大量積累的谷氨酸等產物和代謝中間物的反饋阻遏和抑制,NCgl0616可以去乙?；?提高PEPC的比活性,從而維持PEPC酶活,使代謝流繼續向著合成谷氨酸的方向進行。

2.2 α-酮戊二酸脫氫酶復合物酶活調控

ODHC能夠催化谷氨酸的前體物質α-酮戊二酸形成琥珀酰-CoA,因此,ODHC活性的降低,能夠改變代謝分布,使其集中流向谷氨酸合成方向,對谷氨酸的大量合成有重要作用。

研究表明,ODHC的酶活受OdhI的磷酸化狀態調節,OdhI由含有兩個磷酸化位點(Thr14和Thr15)的N端和C端結構域組成,蛋白激酶G(PknG)可以對OdhI進行磷酸化,磷酸化的OdhI結構發生改變并從OdhA上脫離下來,從而解除對ODHC的抑制,非磷酸化的OdhI通過C端FHA域與ODHA結合從而抑制ODHC的酶活,敲除pknG能夠提高谷氨酸的產量[21-22]。Kim等[23]用蛋白質印跡法測定青霉素和Tween 40添加后谷氨酸生產階段的蛋白含量,發現未磷酸化的OdhI含量明顯高于磷酸化的OdhI,ODHC酶活測定表明,ODHC活性明顯降低[24],從而表明大量增加的未磷酸化的OdhI抑制了ODHC酶活。

ODHC存在多個賴氨酸位點,易進行乙酰化或琥珀酰化,可能會改變ODHC的活性[19]。進一步研究表明,OdhI的FHA結構域中兩個賴氨酸殘基Lys52和Lys132有乙?；顽牾；稽c,Lys132的琥珀酰化降低OdhI對OdhA的親和力,從而減弱OdhI對ODHC的抑制作用,使谷氨酸的產量降低,而K132R(非酰基化突變)能夠消除親和力的變化。Tween 40誘導的谷氨酸產生階段伴隨OdhI的琥珀?；揎?因此OdhI的琥珀酰化可能對谷氨酸的合成起負調控作用[25]。以上結果表明,磷酸化和琥珀酰化都能夠調控谷氨酸的合成,可能通過這種酶活的調控方式,改變代謝流的分布,從而進一步增加谷氨酸的合成。

3 谷氨酸分泌的影響因素

3.1 細胞膜和細胞壁結構改變

細胞表面結構與功能方面的特異性變化是谷氨酸向胞外分泌的關鍵,對谷氨酸的大量分泌有重要影響。脂肪酸是細胞膜的重要組成部分,DtsR蛋白(乙酰輔酶A羧化酶)參與脂肪酸的合成[26]。生物素限量或添加Tween 40誘導谷氨酸產生時伴隨DtsR蛋白含量減少,因此推測谷氨酸的合成與DtsR含量密切相關[27]。Kimura等[28]將dtsR敲除后發現即使在生物素過量的情況下,不添加任何誘導物也能觀察到谷氨酸的分泌,過表達則會抑制分泌,同時生物素限量、添加Tween 40誘導或敲除dtsR基因都能引起ODHC酶活的降低。因此推論DtsR蛋白是通過影響ODHC活性間接影響谷氨酸合成途徑的。

谷氨酸棒狀桿菌細胞壁中含有大量分支菌酸,它是一類含60～90個碳原子的分支長鏈β-羥基脂肪酸。分支菌酸連接在由阿拉伯糖和半乳聚糖交替連接形成的雜多糖鏈上,并通過磷脂鍵與肽聚糖鏈相連接[29]。谷氨酸分泌時往往伴隨分支菌酸的減少,其原因可能是青霉素能夠抑制肽聚糖層的形成,而生物素限量和Tween 40抑制了脂肪酸的合成[30]?？傊?分支菌酸的缺損一方面使細胞膜(壁)通透性增加,另一方面使細胞內滲透壓發生變化從而激活了谷氨酸運輸蛋白,促進了谷氨酸的分泌。

3.2 膜蛋白

細胞膜(壁)結構的改變和擁有谷氨酸運輸載體是谷氨酸大量分泌不可欠缺的條件,谷氨酸的分泌是利用細胞膜上的運輸蛋白為介導的運輸過程[6]。目前多見報道的谷氨酸運輸蛋白有NCgl1221和MscCG2編碼的細胞膜蛋白。

3.2.1 NCgl1221型運輸蛋白 研究表明谷氨酸主要運輸蛋白具有機械敏感通道蛋白活性,位于細胞質膜上由NCgl1221編碼,有4個跨膜結構域。谷氨酸通過該蛋白以被動擴散的方式穿過細胞膜[31-32],這一方式適應于谷氨酸分泌這種較慢的運輸過程,不適應于響應劇烈或損傷性的脅迫如滲透壓沖擊[33]。NCgl1221的N端(1～286)與E.coli的MscS型機械敏感通道高度同源,主要差異是NCgl1221有額外的長為247個氨基酸的C端,包括位于細胞質內結構域的287～401氨基酸,402～419氨基酸的跨膜螺旋與420～533氨基酸位于胞質外結構域[34]。生物素限量或Tween 40、青霉素誘導時,NCgl1221缺失喪失了大量分泌谷氨酸的能力,導致細胞內谷氨酸大量積累,過表達則會增加谷氨酸分泌[32]。Yamashita等[34]通過構建一系列截短的NCgl1221的C端和N端區域突變體及大腸桿菌MscS和谷氨酸棒狀桿菌MscCG的兩種蛋白質的融合體,發現NCgl1221的N端是谷氨酸分泌的必要結構,用膜片鉗電生理技術也證實了N端的分泌作用。用3D同源建模的方法,發現NCgl1221的N端221～232位的氨基酸殘基形成一個回環形結構,敲除該回環結構幾乎會失去分泌谷氨酸的能力,大多數MscS型蛋白不具有該結構,因此該結構與谷氨酸的合成分泌密切相關。

NCgl1221的C末端截短(420～533)是一種獲得功能性突變,突變株可以在生物素過量而沒有誘導物(青霉素或Tween 40)添加時大量分泌谷氨酸。然而,當過表達ODHC抑制蛋白OdhI時,只有少量谷氨酸可以在生物素過量而沒有誘導物添加時分泌;敲除odhI的突變株在誘導時基本不分泌谷氨酸[35]。這些結果表明,NCgl1221調節谷氨酸分泌的作用優先于OdhI。NCgl1221的不同激活狀態(如誘導物的不同)可能會影響ODHC酶活,ODHC酶活受OdhI調節,對于OdhI與NCgl1221共同調節谷氨酸分泌的關系目前尚不清楚。此外,NCgl1221的C末端有降低通道激活閾值與減緩通道關閉的作用,而且C端對E.coli的MscS通道有正調控作用[36]。

3.2.2 MscCG2型運輸蛋白 誘導谷氨酸分泌過程中,NCgl1221缺失時仍可分泌少量谷氨酸;當胞內谷氨酸濃度低于胞外時,也能觀察到谷氨酸的分泌。然而,NCgl1221中并沒有發現ATP結合位點,因此在谷氨酸棒狀桿菌中除了NCgl1221系統外,可能還存在其他ATP依賴的谷氨酸運輸系統或分泌通道[37-38]。Wang等[39]發現了另一個能夠分泌谷氨酸的小電導機械敏感型離子通道MscCG2,它只存在于部分谷氨酸棒狀桿菌中,在生物素限量或青霉素誘導時才能被激活。MscCG2與MscCG具有較低的氨基酸序列同源性(23%),表明它們很可能具有不同的進化起源。MscCG2分泌谷氨酸的能力弱于MscCG。研究中將MscCG2與綠色熒光蛋白進行融合表達,確定該蛋白位于細胞質膜,其具有三個跨膜螺旋的N-末端區域位于細胞質膜中,而C末端位于細胞質膜內?？傊?谷氨酸的分泌主要是通過細胞膜上的運輸蛋白完成,誘導物能夠改變細胞表面結構從而激活運輸蛋白。正是谷氨酸運輸蛋白具有的這種特殊結構,賦予了其能夠大量釋放細胞內谷氨酸的能力。

4 結論與展望

谷氨酸的大量合成是由多因子協同作用的,基因表達調控與蛋白質修飾作用在全局水平調控谷氨酸合成,關鍵酶酶活的改變促進代謝流流向谷氨酸的合成方向,細胞膜(壁)結構改變激活谷氨酸運輸蛋白,使谷氨酸得以大量分泌。盡管很多報道已經證實轉錄水平能夠有效調控谷氨酸分泌,但相關誘導物調控轉錄機理以及谷氨酸大量分泌對細胞的生理作用未見報道。盡管谷氨酸棒狀桿菌的產酸能力伴隨著谷氨酸發酵生產發展獲得了很大的提高,但在高產谷氨酸棒狀桿菌基礎上進行基因工程技術研究以提高谷氨酸產量和糖酸轉化率仍有相對難度。為更好的了解谷氨酸合成的分子機理,需要對蛋白質翻譯后修飾及相互作用機理、誘導物對轉錄水平的相關調控機理、谷氨酸大量分泌對細胞的生理作用等進行深入研究,并在基因組范疇分析谷氨酸合成機理。谷氨酸生物合成涉及復雜的調控網絡,生物內在因素和外界環境均可影響谷氨酸的合成,從分子的角度看,基因表達水平與蛋白質修飾均能夠整體調控合成網絡,其中的刺激因子和抑制因子還有待于深入研究。通過對相關機理的研究,為改造生物產品生產菌提供理論基礎,從而實現產物的最大積累,滿足我國對微生物產品的不斷需求。