吡菲尼酮抑制TGF-β/Smad信號通路緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝硬化

馮 雪 李 毅 陳譚昇 余永勤 呂其軍

(勝利油田中心醫(yī)院感染科，東營 257034)

肝硬化是一種不同病因長期持續(xù)性作用于肝臟組織的末期階段，其是在正常肝細胞壞死的基礎(chǔ)上，殘存肝細胞結(jié)節(jié)性再生、結(jié)締組織增生與纖維隔形成[1]。在肝硬化發(fā)展前期，肝星狀細胞激活分化過程中分泌產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和假小葉形成，進而引起肝臟形變、發(fā)展為肝硬化[2,3]。肝硬化病因很多，在我國主要是以病毒性肝炎引起的肝硬化為主。目前,肝硬化臨床上無特效治療藥物，此病患者如果在早期肝硬化階段能夠及時有效的救治，對于改善患者臨床結(jié)局具有重要的作用。TGF-β/Smad信號通路能夠調(diào)控肝臟膠原基因的表達和細胞外基質(zhì)的合成，是促進肝纖維化重要的信號通路之一，肝纖維化是肝硬化重要的前期發(fā)展階段，抑制肝纖維化有助于緩解肝硬化的發(fā)生與發(fā)展[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)吡啶酮類化合物能夠逆轉(zhuǎn)細胞外基質(zhì)的沉積，有效預(yù)防肺纖維化[6,7]。吡菲尼酮作為吡啶酮類化合物，目前對于其在抗肝纖維化和肝硬化的研究較多，本次研究使用吡菲尼酮治療四氯化碳和乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝硬化，同時探究吡菲尼酮對于TGF-β/Smad信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57BL/6雄性小鼠購買于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，體重22～24 g，8～10周齡，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF條件下，每12 h晝夜交替1次，保證小鼠食物和飲水充足。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及處理 小鼠分組：60只C57BL/6雄性小鼠，隨機分為空白組、模型組和低中高給藥組，每組12只，小鼠給藥：吡菲尼酮溶解于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，低中高劑量組分別按小鼠體重灌胃50、100和200 mg/kg的吡菲尼酮溶液，模型組和空白組分別灌胃給予相等體積的空白溶劑。

四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝硬化造模:隨機取12只做空白對照組，給予大豆油腹腔注射，自由飲水；其余48只小鼠腹腔注射20% CCl4大豆油溶液(5 ml/kg)，每周2次，連續(xù)造模7周，自造模開始后第3周自由飲用20%乙醇水溶液。造模結(jié)束后按照上述給藥方式分組給藥治療，每天灌胃1次，治療2周。

1.2.2藥物治療結(jié)束后所有小鼠摘眼球處死，收集小鼠血液凝固后取血清，使用ALT和AST試劑盒檢測小鼠血清ALT和AST指標(biāo)，檢測小鼠肝臟破壞程度。

1.2.3檢測指標(biāo)

1.2.3.1肝脾指數(shù)測定 稱取小鼠體重、肝臟和脾臟重量，計算小鼠肝臟和脾臟指數(shù)。

1.2.3.2切取小鼠同一部位肝臟組織進行石蠟包埋和HE染色，綜合肝臟病理學(xué)損傷程度進行組織病理學(xué)評價。

1.2.3.3使用免疫組化染色檢測TGF-β1蛋白在小鼠肝臟組織的分布情況。評估藥物治療改善TGF-β1分布范圍。

1.2.3.4使用q-PCR法檢測TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和Smad3的基因表達水平，檢測藥物吡菲尼酮對于TGF-β/Smad信號通路的基因水平的調(diào)節(jié)作用。

1.2.3.5使用Western blot方法檢測TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和Smad3的蛋白水平，檢測藥物吡菲尼酮對于TGF-β/Smad信號通路的蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。

2 結(jié)果

2.1小鼠血清ALT、AST檢測 在模型組中小鼠血清ALT、AST含量顯著上升(P<0.05)，吡菲尼酮灌胃治療后3組小鼠血清ALT、AST含量顯著下降(P<0.05),其中高劑量組效果更為顯著。具體結(jié)果見圖1。

2.2小鼠肝臟、脾臟指數(shù)測定 模型組小鼠脾臟和肝臟腫脹嚴重，與空白對照組相比肝臟、脾臟指數(shù)顯著上升(P<0.05)，給藥治療后肝脾腫脹較模型組相比顯著下降(P<0.05)。具體結(jié)果見圖2。

圖1 各組小鼠血清ALT、AST含量比較Fig.1 Comparison of content of ALT and AST in serum of miceNote: Model group vs control group,###.P<0.001；different dose groups vs model group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖2 各組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)比較Fig.2 Comparison of liver and spleen index of miceNote: Model group vs control group，###.P<0.001；different dose groups vs model group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 小鼠肝臟組織HE染色比較Fig.3 Comparison of HE staining in liver tissues of mice

圖4 免疫組化染色檢測TGF-β1蛋白在小鼠肝臟組織中的表達Fig.4 Immunohistochemical staining was used to detect expression of TGF-β1 protein in mouse liver tissue

圖5 TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和Smad3的基因表達水平比較 Fig.5 Comparison of gene expression levels of TGF-β1 and Smad3 TGF-β/Smad signalingNote: Model group vs control group，###.P<0.001；different dose groups vs model group,*.P<0.05,***.P<0.01.

2.3小鼠肝臟組織HE染色比較 空白組小鼠肝臟組織細胞排列整齊，細胞形態(tài)規(guī)則，模型組小鼠肝臟組織細胞排列散漫，形狀不規(guī)則，細胞腫大明顯，給藥后肝臟細胞形態(tài)有所恢復(fù)，排列較模型組整齊。具體結(jié)果見圖3。

2.4免疫組化染色檢測TGF-β1蛋白在小鼠肝臟組織的分布情況 模型組小鼠肝臟組織中TGF-β1在匯管區(qū)聚集，且較空白組相比，模型組TGF-β1陽性細胞數(shù)目顯著增多，給藥后陽性細胞數(shù)目較模型組相比顯著減少。具體結(jié)果見圖4。

2.5TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和 Smad3的基因表達水平 TGF-β1在模型組基因表達水平較空白組相比升高了近10倍，同樣的Smad3蛋白基因水平較空白組相比升高了近3倍，模型組較空白組相比具有顯著性(P<0.05)，各給藥組小鼠肝臟組織TGF-β1和Smad3蛋白的基因水平較模型組相比顯著下降(P<0.05)，具體結(jié)果見圖5。

圖6 TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和Smad3的蛋白水平Fig.6 Protein level of TGF-β1 and Smad3 in TGF-β/Smad signaling pathway

2.6TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白TGF-β1和Smad3的蛋白水平 TGF-β1和Smad3蛋白在小鼠肝臟中具有一定程度的表達，同時使用四氯化碳和乙醇造模的小鼠中TGF-β1和Smad3蛋白的表達顯著增高，給藥后各組小鼠的TGF-β1和Smad3的表達有所下調(diào)，具體結(jié)果見圖6。

3 討論

肝臟發(fā)生慢性炎癥后機體會自發(fā)產(chǎn)生損傷修復(fù)，修復(fù)反應(yīng)往往導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積繼而發(fā)生肝纖維化，慢性持續(xù)性炎癥的長期刺激最終導(dǎo)致肝硬化的形成[8]。肝硬化是肝癌誘發(fā)病因中最直接和主要的因素[9,10]。目前臨床上針對不同病因的肝硬化治療各具特色，早期肝硬化的治療對于改善患者臨床癥狀和生存條件至關(guān)重要。已知以細胞外基質(zhì)過度沉積為標(biāo)記的肝星狀細胞激活及其分化對于肝纖維化向肝硬化的轉(zhuǎn)變極為重要，同時已有研究證明肝纖維化患者中TGF-β/Smad信號通路處于激活狀態(tài)，并且在疾病轉(zhuǎn)化中扮演著重要的角色[11,12]。

本研究采用四氯化碳和乙醇共同刺激小鼠產(chǎn)生早期肝硬化，結(jié)果顯示模型組中小鼠血清ALT、AST含量顯著上升，說明四氯化碳和乙醇對于肝細胞具有強烈的細胞毒性作用，這與孔今波等[13]的研究具有很大的相似之處。同時研究結(jié)果顯示模型組小鼠肝脾腫大嚴重，肝臟、脾臟指數(shù)顯著上升，這與HE染色結(jié)果一致，肝細胞腫脹、變性壞死嚴重，同時肉眼可見肝臟表層有結(jié)節(jié)產(chǎn)生。這與Shawi等[14]在肝硬化模型中觀測到的結(jié)果相似。使用q-PCR 和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)模型中TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵因子TGF-β1、Smad3基因和蛋白表達顯著上調(diào)，TGF-β/Smad信號通路在早期肝硬化中同樣處于激活狀態(tài)，使用吡菲尼酮灌胃治療后能夠有效抑制小鼠肝臟組織中TGF-β/Smad信號通路的激活，緩解四氯化碳和乙醇誘導(dǎo)的小鼠早期肝硬化?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果可知吡菲尼酮能夠通過抑制TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵因子TGF-β1、Smad3基因和蛋白表達緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝硬化。