杜仲綠原酸對LPS誘導的視網膜內皮細胞凋亡和免疫反應的調控作用①

劉 嫻 姜玉珍 田 聘 梁 莉

(南陽醫專第一附屬醫院眼科，南陽 473000)

近年來糖尿病的患病率在全球范圍不斷上升，其最常見的并發癥之一糖尿病性視網膜病變也隨之增加。糖尿病性視網膜病變是發達國家勞動力人口視力喪失的主要原因。糖尿病視網膜病變導致的視力障礙對患者的生活質量和他們成功控制疾病的能力產生了嚴重的負面影響[1]。越來越多的研究表明在糖尿病視網膜病變患者中常常可以檢測到一些內皮黏附因子的升高，這些因子的升高會導致持續的炎癥反應，炎癥反應在糖尿病性視網膜病變過程中發揮著重要作用，因此糖尿病性視網膜病變也被認為是一種慢性的輕型炎癥反應[2]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要結構成分，是許多疾病中引發炎癥反應的重要介子之一，LPS的增加會導致促炎因子分泌的增強[3]。許多天然產物和植物提取物在抑制炎癥方面發揮著積極作用[4,5]。杜仲綠原酸(Chlorogenic acid,CA)(化學結構式見圖1A)是羥基肉桂酸家族中的一種酚類化合物，這種多酚具有許多促進健康的特性，其中大部分都與代謝綜合征的治療相關，包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗高血壓等活性[6]。本文主要目的是探索CA對LPS誘導的視網膜內皮細胞(Human retinal endothelial cells,HRECs)凋亡和免疫反應的調控作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥物 CA來源于Sigma-Aldrich公司，貨號與規格： 00500590-10 mg，HPLC≥97%，用DMSO配制成400 μmol/L的母液，使用時稀釋到所需濃度。LPS來源于Sigma公司,貨號與規格： L4516-1 mg，用PBS配制成100 ng/ml的溶液待用。

1.1.2細胞系及藥物處理 HRECs細胞來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。HRECs細胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基中置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞增殖到約80%時進行傳代。不同濃度(1、2、5、10、20、50、100、200、400 μmol/L)CA處理HRECs后利用CCK-8檢測細胞存活率。后續實驗選擇10、20、50 μmol/L的CA進行處理。HRECs細胞分為5組：對照組(HRECs)、模型組(LPS)、CA組(LPS+10、20、50 μmol/L 杜仲綠原酸)。模型組用100 ng/ml的LPS處理。CA組用100 ng/ml的LPS聯合10、20、50 μmol/L CA進行處理。對照組用DMSO處理。

1.1.3試劑 培養基 DMEM(Thermo Fisher Science,11966-025),胎牛血清(Thermo Fisher Science,10099158)。CCK-8試劑盒(Dojindo Laboratories,CK04)。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen,556547)。IL-6的ELISA檢測試劑盒(Thermo Fisher Science,BMS213-2)。TNF-α的ELISA檢測試劑盒(MSK,69-98069)。IL-10的ELISA檢測試劑盒(Thermo Fisher Science,BMS215-2)。抗Ki67抗體(Abcam,ab16667)，抗Bcl-2抗體(Abcam,ab32124)，抗Caspase-3抗體(Abcam,ab13585)，抗Bax抗體Abcam,ab32503)，抗NF-κB P65抗體(Abcam,ab16502)。抗P-NF-NF-κB P65抗體(Abcam,ab28856)。

1.1.4儀器 CO2培養箱是賽默飛Thermo 371系列。超凈臺是賽默飛Heraguard ECO系列。離心機購自美國貝克曼公司。流式細胞分析儀來源于BD公司。分光光度計、光學顯微鏡，凝膠成像系統及電泳儀由美國伯樂公司提供。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細胞增殖 首先用培養基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，然后在37℃培養1～4 h，最后在450 nm處檢測吸光值，計算細胞增殖倍數。

1.2.2流式細胞術分析細胞凋亡 收集待測細胞后用1×Binding buffer制成1×106個/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測。

1.2.3蛋白印跡 首先將待測細胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.4酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 按照ELISA試劑盒說明書檢測各組待測細胞提取物中的炎癥因子水平，首先將樣品加入反應孔后37℃孵育45 min，洗滌液洗滌4次后加入生物素標記的抗體37℃反應30 min。然后加鏈霉親和素-HRP 混勻37℃反應30 min。最后加入顯色劑，避光顯色15 min后加終止液終止反應，450 nm 處檢測吸光值

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CA對HRECs細胞活力的影響 利用CCK-8檢測CA對HRECs細胞活力的影響。由圖1B可知，當CA<50 μmol/L時，HRECs細胞存活率維持在80%以上，對HRECs細胞活力無明顯影響；CA>50 μmol/L 后HRECs細胞存活率急劇下降，降低到80%以下。上述結果表明，低濃度(<50 μmol/L)的CA對HRECs細胞活力無明顯影響，高濃度(>50 μmol/L)的CA會減低HRECs細胞活力。

2.2CA可減弱LPS誘導的HRECs細胞增殖降低 為分析CA對LPS誘導的HRECs細胞增殖的影響，CCK-8檢測HRECs細胞增殖倍數。圖2顯示，LPS組細胞增殖倍數明顯低于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組細胞增殖倍數無明顯變化。20 μmol/L和50 μmol/L的CA組細胞增殖倍數明顯高于LPS組(P<0.05)。由此可見，CA具有降低LPS誘導的HRECs細胞增殖減低的功能。

圖1 CA化學結構式(A)和CCK-8檢測細胞活力(B)Fig.1 Chemical structure of CA(A)and cell viability was detected by CCK-8(B)

2.3CA會抑制LPS誘導的HRECs細胞凋亡增加 通過流式細胞術檢測HRECs細胞凋亡，分析CA對LPS誘導的HRECs細胞凋亡的影響。如圖3所示，LPS組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。10 μmol/L的CA組與LPS組細胞凋亡率無明顯差異。與LPS組相比，20和50 μmol/L的CA組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。以上結果說明，CA可抑制LPS誘導的HRECs細胞凋亡的增加。

2.4CA對HRECs細胞增殖凋亡相關蛋白表達的影響 蛋白印跡檢測CA對LPS誘導的HRECs細胞增殖凋亡相關蛋白表達的影響。圖4顯示，LPS組Ki67和Bcl-2表達明顯低于對照組，Caspase-3和Bax表達明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組Bax表達明顯下降；20 μmol/L和50 μmol/L的CA組Ki67和Bcl-2表達明顯升高，Caspase-3和Bax表達明顯降低(P<0.05)。由此可見，CA可減弱LPS誘導的HRECs細胞Ki67和Bcl-2表達的減低及Caspase-3和Bax表達的增強。

2.5CA可抑制LPS誘導的HRECs的炎癥反應增強 利用ELISA檢測HRECs細胞炎癥因子水平，分析CA對LPS誘導的HRECs炎癥反應的影響。如圖5所示，LPS處理HRECs細胞后促炎因子IL-6和TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10水平降低(P<0.05)。與LPS組相比，10 μmol/L的CA組炎癥因子水平無明顯變化；20 μmol/L和50 μmol/L的CA組IL-6和TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。以上結果說明，CA會抑制LPS誘導的HRECs細胞炎癥反應的增強。

圖2 CCK-8檢測細胞增殖Fig.2 Proliferation was measured by CCK-8Note: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was tested by flow cytometryNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖4 蛋白印跡檢測細胞增殖凋亡相關蛋白表達Fig.4 Expression of proliferation and apoptosis related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖5 ELISA檢測細胞炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factors were detected by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖6 蛋白印跡檢測NF-κB信號通路相關蛋白表達Fig.6 Expression of NF-κB pathway related protein was detected by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

2.6CA對NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 為探索CA影響LPS誘導的HRECs細胞炎癥反應的分子機制，蛋白印跡檢測NF-κB P65和P-NF-κB P65蛋白水平。由圖6可知，LPS組p-P65/P65比值明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，CA(10、20、50 μmol/L)組p-P65/P65比值明顯降低(P<0.05)。上述結果表明，CA可減弱LPS誘導的HRECs細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高，抑制NF-κB P65的活化。

3 討論

目前對糖尿病性視網膜病變治療的主要手段是鐳射光凝療法，但經過鐳射光凝療法后常會導致糖尿病性黃斑水腫。近年來也發現一些糖尿病性視網膜病變治療方法，如玻璃體切割術，抗VEFG及非諾貝特等藥物，但許多糖尿病性視網膜病變患者對這些療法的反應并不理想[7,8]。開發新的有效的糖尿病性視網膜病變治療方法迫在眉睫。

越來越多的研究表明多種植物提取物具有調控細胞增殖和凋亡的作用[9]。有研究發現藍莓花色苷具有抑制光誘導的視網膜色素上皮細胞PRE增殖能力降低的功效[10]。Sook Kim等[11]研究表明葛根提取物可減弱丙酮醛誘導的視網膜色素上皮細胞PRE的增殖的降低，細胞凋亡的增加。據報道綠原酸可促進成骨細胞增殖，減少細胞凋亡，抑制Bcl-2表達的降低和Bax表達的升高[12]。有研究表明在大鼠髓核細胞中，綠原酸會降低H2O2誘導的細胞凋亡，增強Bcl-2表達[13]。有數據顯示在大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞中，綠原酸可抑制乙醇誘導的細胞增殖降低和細胞凋亡增加，減弱Bcl-2表達的降低和Caspase-3表達的升高[14]。本文結果顯示，CA可減弱LPS誘導的HRECs細胞增殖下降和細胞凋亡增加，抑制Ki67和Bcl-2表達的減低和Caspase-3和Bax表達的增強。

炎癥反應的增強是各種疾病的常見特征，大量文獻報道許多植物提取物具有抗炎的功效。有研究顯示鼓槌石斛提取物可減弱鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜細胞IL-6和TNF-α水平的增加[15]。Tzeng等[16]發現富含多酚類物質的紅球姜提取物可降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放。據報道一種黃芪、當歸、人參提取物可抑制高糖誘導的內皮細胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高[17]。有數據顯示綠原酸可降低LPS誘導的巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高[18]。有研究表明綠原酸可抑制LPS誘導的肝星狀細胞IL-6水平的升高，減弱炎癥反應[19]。據報道綠原酸會降低全氟辛烷磺酸誘導的人臍靜脈內皮細胞IL-1β和IL-6水平的升高[20]。本研究結果表明，CA可抑制LPS誘導的HRECs細胞IL-6和TNF-α水平升高和IL-10水平降低。

NF-κB信號通路在LPS誘導的炎癥反應過程中起著重要作用[21]。有研究發現印度人參提取物可通過抑制NF-κB通路活化，減弱LPS對腎小管上皮細胞的促炎作用[22]。據報道半枝蓮提取物可降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高[23]。有研究表明紅球姜提取物可通過降低NF-κB P65磷酸化水平來減弱鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠視網膜細胞炎癥反應[24]。Ye等[25]發現在LPS誘導的急性腎損傷中綠原酸會降低P-NF-κB P65蛋白水平的升高[26]。有數據顯示綠原酸可通過降低NF-κB P65磷酸化水平抑制LPS誘導的乳腺炎。本文結果顯示，CA可抑制LPS誘導的HRECs細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

本研究表明，在LPS誘導的HRECs細胞中，CA可減弱細胞增殖的下降和細胞凋亡的上升，抑制Ki67和Bcl-2表達的減低和Caspase-3和Bax表達的增強，減少IL-6和TNF-α水平升高和IL-10水平降低，降低NF-κB P65磷酸化水平的升高。綜上所述，杜仲綠原酸可通過抑制NF-κB P65活化減弱LPS誘導的HRECs細胞凋亡和炎癥反應的增強。下一步計劃在動物模型中研究CA對糖尿病性視網膜病變的調控作用，為開發新的糖尿病性視網膜病變治療方法奠定基礎。