川芎嗪抑制NF-κB P65磷酸化對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應的調節作用①

朱海泉 劉子敏 孟祥圣 孫 曉 王黎明

(南京醫科大學連云港臨床醫學院急診外科，連云港 222002)

骨關節炎是最常見的慢性關節疾病，涉及炎癥和關節結構改變，會出現疼痛甚至關節功能障礙[1]。全世界60歲以上的人中約有10%的男性和18%的女性患有骨關節炎。骨關節炎是造成世界范圍內疼痛、殘疾和社會經濟負擔的主要原因[2]。骨關節炎治療是醫療健康事業的重大課題，開發有效的骨關節炎治療方法迫在眉睫。草藥被運用于骨關節炎的治療已具有悠久的歷史[3,4]。川芎的根或根莖可作為天然草藥，在血管舒張、抗炎、抗凝血及自由基清除等方面發揮著積極作用[5]。川芎嗪(Ligustrazine)(化學結構式見圖1)是川芎的主要活性物質，屬于生物堿類化合物，存在多種藥理學活性，可改善腦缺血/再灌注損傷，酒精性肝損傷及心絞痛等[6-9]。川芎嗪在調節細胞凋亡和炎癥反應方面起著重要作用[10]。本研究主要目的是通過LPS處理人膝關節軟骨細胞誘導骨關節炎，探索川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物 川芎嗪(貨號與規格：95162，100 mg)分析純、LPS(貨號與規格：L3012，10 mg)來源于Sigma公司。

1.1.2試劑 DMEM-F12培養基(貨號：11320-033)、胎牛血清(貨號：10099158)來源于Thermo Fisher公司;Hoechst33258染色試劑盒(貨號：C0003)、白細胞介素(Interleukin,IL)-6的ELISA檢測試劑盒(貨號：PI330)來源于Beyoptime公司；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的ELISA檢測試劑盒(貨號：69-98069)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)的ELISA檢測試劑盒(貨號：69-20148)來源于MSK公司；抗II型膠原( collagen II)抗體(貨號：ab34712)、抗基質金屬蛋白酶-13( Matrix metalloproteinase 13,MMP-13 )抗體(貨號：ab39012)、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗體(貨號：ab3778)、抗NF-κB P65抗體(貨號：ab207297)、抗p-NF-κB P65抗體(貨號：ab222494)來源于Abcam公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養箱是Thermo 371系列；超凈臺為賽默飛Heraguard ECO型；離心機購自美國貝克曼庫爾特公司。倒置顯微鏡、分光光度計、熒光顯微鏡、凝膠成像系統及電泳儀購自美國伯樂公司。

1.1.4組織標本 標本取自南京醫科大學附屬南京醫院骨科截肢患者的手術膝骨關節軟骨，標本獲取均得到患者知情同意。

1.2方法

1.2.1細胞分組與藥物處理 人膝骨關節軟骨細胞分為4個組：對照組、川芎嗪組、LPS組和川芎嗪+LPS組。用用LPS(100 ng/ml)刺激軟骨細胞8 h誘導骨關節炎，用20 μmol/L的川芎嗪處理細胞24 h對照組用DMSO處理。

圖1 川芎嗪化學結構式Fig.1 Chemical structure of ligustrazine

1.2.2軟骨細胞原代分離 首先將膝骨關節軟骨塊剪碎成1 mm3的小塊，放入離心管中，加入2倍體積的Ⅱ 膠原酶，置于37℃、5%CO2的培養箱中消化15 h。用60目濾網過濾上述混合液，濾液移入新的離心管中進行離心，800 r/min,6 min。棄上清，取下層渾濁液加入2倍體積的含15%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM-F12培養基混勻分裝到細胞培養瓶中，于37℃、5%CO2的培養箱培養，每3～5 d更換培養液。

1.2.3Hoechst33258染色檢測細胞凋亡 待測細胞接種于鋪有細胞爬片的培養皿中，37℃、5%CO2的恒溫培養至長滿60%～80%時，除去培養液，按照Hoechst33258染色試劑盒說明書對待測細胞依次進行固定，染色和封片。熒光顯微鏡下激發波長350 nm，發射波長460 nm觀察細胞，并統計凋亡細胞數目。

1.2.4蛋白印跡 各組細胞經PBS清洗后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。然后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。經5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.5酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbentassay,ELISA) 收集待測細胞培養物上清，按照ELISA試劑盒說明書分別檢測NO、TNF-α和 IL-6的含量。首先樣品加入反應孔后37℃孵育30 min，洗滌液洗滌后加入酶標試劑37℃反應30 min。然后加顯色試劑37℃避光顯色15 min。最后加終止液終止反應，450 nm處檢測各個反應孔吸光值。

1.3統計學方法 用SPSS16.0軟件進行實驗數據的統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，P<0.05認為差異存在明顯統計學意義。

2 結果

2.1川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞形態及數目的影響 倒置顯微鏡下觀察發現，對照組和川芎嗪組細胞形態呈長梭狀，分布密集；LPS組多數細胞皺縮，形態異常，分布稀疏；LPS+川芎嗪組大部分細胞呈長梭狀，小部分有皺縮現象，分布較密集(圖2A)。圖2B顯示，LPS組細胞數目明顯少于對照組(P<0.05)。LPS+川芎嗪組細胞數目明顯多于LPS組(P<0.05)。由此可見，川芎嗪可改善LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞形態異常及數目的下降。

2.2川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡的增加 通過Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，探究川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡的影響。圖3顯示，對照組和川芎嗪組細胞核完整、形態規則、呈橢圓形、為正常細胞。LPS組絕大多數細胞核呈致密濃染，形態異常，顏色有些發白，為凋亡細胞。LPS+川芎嗪組大部分為正常細胞。LPS組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+川芎嗪組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。上述結果表明，川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡的增加。

2.3川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞胞外基質相關蛋白表達的影響 蛋白印跡檢測Ⅱ型膠原，聚集蛋白聚糖和MMP-13的表達，分析川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞胞外基質相關蛋白表達的影響。如圖4所示，LPS組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達水平明顯低于對照組，MMP-13表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+川芎嗪組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達水平明顯升高，MMP-13表達水平明顯下降(P<0.05)。由此可見，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強。

圖2 川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞的影響Fig.2 Effect of ligustrazine on LPS-induced osteoar-thritis chondrocytesNote: A.The morphology chondrocytes;B.The umber of chondrocytes.*.P<0.05 vs control group,#.P<0.05 vs LPS group.

2.4川芎嗪會降低LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞炎癥反應 利用ELISA檢測炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的含量，分析川芎嗪對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞炎癥反應的影響。由圖5可知，LPS組NO、TNF-α和IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05)。LPS+川芎嗪組NO、TNF-α和IL-6水平卻明顯低于LPS組(P<0.05)。以上結果說明，川芎嗪會降低LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞炎癥反應的增強。

2.5川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化 為探究川芎嗪影響LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞的分子機制，蛋白印跡檢測NF-κB P65的磷酸化水平。圖6顯示，各組細胞NF-κB P65蛋白水平無明顯差異，LPS組p-NF-κB P65蛋白水平最高。與對照組相比，LPS組p-P65/P65比值明顯升高(P<0.05)。LPS+川芎嗪組p-P65/P65比值明顯低于LPS組(P<0.05)。上述結果表明，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

圖3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by Hoechst33258 stainingNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖4 蛋白印跡檢測胞胞外基質相關蛋白表達Fig.4 Expression of extracellular matrix-related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖5 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖6 蛋白印跡檢測NF-κBP65的磷酸化水平Fig.6 Phosphorylation of NF-κBP65 was detected by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

3 討論

膝骨關節炎是老年人的常見疾病，2010年中國50歲以上的人口占總人口的25.3%，中國膝骨關節炎的患病率相當高[11]。目前針對骨關節炎的治療策略主要包括生活方式的改變，外科手術、藥物治療及各種療法聯合治療等，以減輕癥狀，改善功能狀態，但這些方法具有一定的限制性[12]。近年來天然產物在疾病治療方面受到了越來越多的關注[13]。

細胞凋亡在各種疾病中發揮著重要作用，許多植物提取物都具有調節細胞凋亡的功效。Lu等[14]發現杜仲水提取物可抑制膝骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡。有研究表明石榴提取物可降低創傷性關節炎兔軟骨細胞凋亡[15]。據報道姜黃素具有抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡的功能[16]。有研究發現川芎嗪具有抑制腦缺血誘導的細胞凋亡及輻射導致的淋巴細胞凋亡[6,17]。此外，川芎嗪還可抑制LPS誘導的大鼠腹膜間皮細胞凋亡和低氧誘導心肌細胞凋亡[18,19]。本研究結果顯示，川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡的增加。

軟骨退化是骨關節炎的主要特征之一，骨關節炎患者常常出現細胞外基質相關蛋白表達的異常，如基質金屬蛋白酶表達的增強，Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖蛋白水平下降[20]。越來越多的研究表明植物提取物可改善各類疾病中細胞外基質的異常。Wang等[21]發現銀杏葉提取物EGb761可抑制TNF-α誘導的膝關節軟骨細胞MMP-13表達的增強和Ⅱ型膠原表達的降低。據報道羊棲菜提取物可減弱H2O2誘導的大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖蛋白表達的下降，抑制MMP-3和MMP-7表達的上升[22]。另外，在TNF-α誘導骨關節炎軟骨細胞中菜薊苦素可減弱MMP-13表達的增強和聚集蛋白聚糖蛋白水平的降低[23]。有研究發現川芎嗪可抑制腰椎間盤退變大鼠Ⅱ型膠原表達的降低和MMP-13表達的增強[24]。本文結果顯示，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強。

炎癥反應在骨關節炎中起著重要作用[25,26]。大量文獻報道植物提取物具有很好的抗炎作用。有數據顯示銀杏葉提取物EGb761可減弱LPS誘導的人軟骨細胞NO、PGE2和 IL-6水平的上升[27]。有研究表明桑葉提取物可抑制IL-1β誘導的人軟骨細胞NO和PGE2水平的升高[28]。在IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中，黃芩根提取物可減弱NO、IL-6和PGE2的釋放[29]。Kim等[30]發現川芎嗪可抑制淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)和干擾素-γ(Interferon-γ,INF-γ)誘導的大鼠小神經膠質細胞TNF-α、IL-1β及MCP-1水平的升高。本研究結果表明，川芎嗪會降低LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞NO、TNF-α和IL-6水平的上升，減輕炎癥反應。

NF-κB通路在各種疾病中起著重要調控作用[31]。許多植物提取物都可以逆轉各類疾病中NF-κB通路的異常。Haseeb等[32]發現富含多酚的石榴提取物會抑制IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的上升[32]。據報道川芎嗪可通過抑制NF-κB通路激活減輕創傷性腦損傷的神經炎癥[33]。在骨肉瘤細胞中川芎嗪處理會導致NF-κB P65由細胞質向細胞核的轉移受阻[34]。本文結果顯示，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

本研究表明，在LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞中，川芎嗪可改善軟骨細胞形態異常及數目的下降，減弱細胞凋亡的增加，抑制Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強，降低NO、TNF-α和IL-6水平的上升，減弱NF-κB P65磷酸化水平的升高。綜上所述，川芎嗪通過抑制NF-κB P65磷酸化減輕LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應。下一步計劃在體內研究川芎嗪對骨關節炎的影響。