抑制食管癌STC-1基因表達對食管癌細胞凋亡、IL-1β和TNF-α表達及JAK2/STAT3信號的影響研究

卜秀梅 王文剛 李 輝 鄭 瑾

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，目前以手術治療為主，雖然治療技術日漸成熟，但患者5年的生存率仍然很低[1]。食管癌的發生發展是一個涉及細胞調控機制異常和多基因改變的長時間、多階段、多因素的復雜過程，目前已發現食管癌相關的癌基因c-myc、cyclinD1等及抑癌基因Rb、p53等的表達改變，其表達改變可影響其生物學性狀[2,3]。因此，探究影響食管癌表觀遺傳學改變及發生發展的機制，對于有效預防及治療食管癌具有重要意義。斯鈣素(Stanniocalcin，STC)是一種在硬骨魚中首先被發現的糖蛋白激素，哺乳動物中有STC1和STC2兩種類型，人類STC1在甲狀腺、腎臟、結腸等多種組織中有表達，參與細胞凋亡、血管生成、氧化應激、線粒體代謝等多種生理及病理過程的調節[4]。目前有多項研究顯示，STC1在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中表達上調，與腫瘤的惡性程度有關,STC1的過表達預示著腫瘤預后差[5-7]。STC1對食管癌發生發展的影響目前研究較少。有研究發現，食管鱗癌中STC1的表達升高，與臨床分期及淋巴結轉移有關，且高、中表達的無進展生存期低于低、未表達者[8]。這提示STC1可能促進了食管鱗癌的發生發展。STC1對食管鱗癌生物學特性影響還未清楚。因此，本研究首先檢測了STC-1在4種食管鱗狀細胞癌細胞系中的表達，選擇表達最高的細胞系；通過STC-1的siRNA轉染該細胞系，檢測STC-1表達下調/沉默對癌細胞活力、凋亡率及炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，并進一步研究引起細胞增殖凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A及人食管鱗狀細胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細胞系均購自遼寧中醫藥大學。

1.1.2試劑和儀器 RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清和青鏈霉素均購自美國Bibco；CCK8試劑購自上海同仁研究所；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司；總RNA提取及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；兔抗人STC-1抗體、鼠抗人Ki67抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(Phosphorylated Janus kinase2，p-JAK2)抗體、兔抗人磷酸化的信號轉導與轉錄因子3(Phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體購自美國Cell signal公司；酶標儀購自美國Thermo Labsystem公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 Het-1A、KYSE170、Eca109、TE1和TE10細胞培養于37℃含5%體積分數的CO2培養箱中，用含胎牛血清及青霉素和鏈霉素雙抗的RPMI1640培養液培養，細胞每2～3 d更換一次培養液，細胞達80%～90%生長融合時，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，接種于6孔板、96孔板或培養瓶中用于實驗研究及傳代。

1.2.2食管癌細胞STC-1的mRNA表達 按照總RNA提取試劑盒提取各細胞中的總RNA，RNA純度測定后逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。其中STC-1和內參GAPDH引物通過Primer Premier 5.0設計，經過BLAST驗證后由上海英駿生物技術公司合成。引物序列如下：STC-1 F：5′-CCAAGGTCTTCCTCGCCATTC-3′，R：5′-ATTCCA-GCAGGCTTCGGACA-3′,195 bp。內參GAPDH的引物為F：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，R：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，258 bp。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，72℃ 5 min，最后4℃保存。根據Ct均值利用2-ΔΔCt比較法計算STC-1的mRNA相對含量。

1.2.3食管癌細胞STC-1、Ki67、p53、p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達 提取各細胞中的總蛋白，BCA法對蛋白定量，每泳道取等量蛋白行SDS-PAGE分離，蛋白分離后電轉移至PVDF膜，電轉好的PVDF膜置于封閉液中2 h，洗封閉好的PVDF膜3次，每次5 min，放置膜于抗體孵育盒中，滴加一抗(STC-1、Ki67、p53、p-JAK2、p-STAT3抗體皆按照1∶500稀釋，內參GAPDH為1∶1 000稀釋)將膜覆蓋完全，4℃過夜，次日取出膜，洗膜后常溫孵育二抗(1∶2 000 稀釋的HRP標記的羊抗兔)2 h，洗膜，顯色液顯色，置于暗室中顯影曝光條帶。以Bandscan5.0軟件對成像圖進行灰度值分析，以目的條帶與GAPDH內參條帶的比值代表蛋白的表達水平。

1.2.4siRNA轉染 以LipofectamineTM2000為載體，參照LipofectamineTM2000說明書，于轉染前24 h接種Eca109細胞至6孔板，觀察到細胞生長達60%融合時轉染，分別給Eca109細胞轉染STC-1-siRNA和陰性對照siRNA序列，分別標記兩組為STC-1-siRNA組和NC組，并設定空白對照組(Control)，收集轉染48 h的細胞，通過RT-PCR及Western blot檢測各組細胞STC-1的表達。其中STC-1的siRNA序列為：sense：5′-TCTTGTACAGCGCTGCTAA-3′，antisense：5′-TTAGCAGCGCTGTACAAGA-3′。

1.2.5轉染STC-1的siRNA后Eca109細胞活力檢測 細胞活力檢測通過CCK8法。在轉染48 h后的每孔細胞中加入CCK8試劑10 μl，孵箱中2 h，利用空白對照孔調零，酶標儀測定450 nm各組的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.2.6轉染STC-1的siRNA后Eca109細胞凋亡檢測 轉染48 h的細胞PBS洗一次，胰酶消化細胞，含有血清的培養基終止細胞消化，離心，棄掉上清，預冷的PBS重懸細胞，離心，棄掉上清，重懸細胞后將細胞濃度調整為1×106ml-1，細胞中加入FITC標記的Annexin V和PI各5 μl，混合均勻后置于室溫環境中避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.7轉染STC-1的siRNA對Eca109細胞IL-1β和TNF-α表達的影響 通過RT-PCR檢測各組細胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表達，方法參照1.2.2。IL-1β和TNF-α的引物分別為：IL-1β：F：5′-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3′,R：5′-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3′,245 bp。TNF-α：F：5′-GAACTCCAGGCGGTGTCT-3′,R：GGCTCATACCAGGGCTTG-3′,510 bp。

2 結果

2.1食管癌細胞STC-1的表達 以正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A為對照，通過RT-PCR及Western blot檢測人食管鱗狀細胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細胞中STC-1的表達，結果如圖1和表1所示，與Het-1A細胞比較，STC-1在KYSE170、Eca109、TE1和TE10細胞中的mRNA及蛋白表達均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2STC-1-siRNA轉染Eca109細胞效果 通過RT-PCR及Western blot分別檢測STC-1-siRNA轉染Eca109細胞48 h后STC-1的表達，結果如圖2和表2所示，NC組STC-1的mRNA及蛋白表達均與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，STC-1-siRNA組STC-1的mRNA及蛋白表達均顯著低于對照組(P<0.05)。

2.3STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞活力及凋亡的影響 CCK8法及流式細胞術分別檢測STC-1-siRNA轉染Eca109細胞48 h的活力及凋亡率，結果如圖3和表3所示，與對照組比較，STC-1-siRNA組細胞活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測STC-1在食管癌細胞的蛋白表達Fig.1 Western blot to detect protein expression of STC-1 in esophageal cancer cells

表1 STC-1在食管癌細胞的mRNA及蛋白相對表達量

Note：Compared with Het-1A cells,1)P<0.05.

圖2 Western blot檢測STC-1-siRNA轉染Eca109細胞后STC-1的蛋白表達Fig.2 Protein expression in STC-1 after STC-1-siRNA was transfected into Eca109 cells detected by Western blot

表2 各組細胞中STC-1的mRNA及蛋白表達

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

2.4STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞IL-1β和TNF-α表達的影響 RT-PCR檢測STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α表達的影響，結果如表4所示，與對照組比較，STC-1-siRNA組IL-1β和TNF-α的表達均顯著降低(P<0.05)。

2.5STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞增殖凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號通路的影響Western blot檢測各組細胞中增殖蛋白Ki67、凋亡蛋白p53及JAK2/STAT3信號通路p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達，結果如圖4和表5所示，與對照組比較，STC-1-siRNA組Ki67、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，p53的蛋白表達顯著升高(P<0.05)。

圖3 STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of STC-1-siRNA transfection on apoptosis of Eca109 cells

表3 STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞活力及凋亡的影響

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

表4 STC-1-siRNA轉染對Eca109細胞IL-1β和TNF-α表達的影響

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測各組細胞中增殖凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號通路蛋白表達Fig.4 Western blot were used to detect protein expression of proliferation and apoptotic protein and JAK2/STAT3 signaling protein expression in each cell

表5 各組細胞中Ki67、P53、p-JAK2和p-STAT3的蛋白相對表達量

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

3 討論

人類STC-1定位于8p11.2-p21染色體，STC-1在多種人類組織中有表達，以自分泌和旁分泌方式參與多種生理和病理過程的調節，近些年發現其與腫瘤的發生發展密切相關[9]。研究發現，STC-1在結腸癌中的上調表達在腫瘤血管發生中有重要作用[10]；卵巢癌中STC-1的過度表達可增加卡鉑的化療抵抗，而沉默其表達可提高卡鉑的敏感性[11]；宮頸癌中STC-1的過表達可抑制癌細胞的增殖、遷移[12]；肺癌細胞中低表達STC-1可降低細胞增殖，阻滯細胞周期，并誘導細胞凋亡[13]。這些前人的研究提示STC-1參與了腫瘤的發生發展。STC-1在食管鱗癌中的研究還未清楚，有研究發現STC-1在食管鱗癌中高表達，可能是食管癌治療的一個有效潛在的標記[8]，但STC-1對食管鱗癌的增殖凋亡的影響及機制還未清楚。

本研究以正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A為對照，檢測人食管鱗狀細胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細胞中STC-1的表達，發現4種細胞中STC-1的表達均顯著升高，這與前人的研究結果是一致的，由于在Eca109細胞中表達最高，因此選擇作為研究對象。RNA干擾具有高效性和很強的特異性，能在轉錄和翻譯水平及染色質水平調節基因表達，目前在基因功能研究、腫瘤治療等方面有廣泛應用[14,15]。因此，本研究通過RNA干擾技術沉默Eca109細胞STC-1的表達，通過CCK8法及流式細胞儀分別檢測細胞活力及凋亡，結果顯示，沉默STC-1表達后Eca109細胞活力顯著降低，凋亡率升高。

JAK/STAT信號通路是一條參與細胞增殖、凋亡、分化調節等生理過程的信號途徑，多種腫瘤中該通路處于激活狀態，可通過調控下游相關基因Ki67、p53等表達影響腫瘤的發生發展[16,17]，有研究發現，通過JAK2抑制劑抑制JAK2/STAT3信號通路后可降低食管鱗癌細胞的增殖及誘導凋亡[18,19]。Ki67是一個可標記細胞增殖狀態的抗原，與惡性腫瘤發生發展有密切關系，其表達的高低可全面、可靠的反映細胞增殖狀態，因此被認為是細胞增殖活力檢測的理想指標，在腫瘤生物學特性研究中有廣泛的應用[20,21]。食管癌中Ki67可較好地反映癌細胞的增殖活性[22]。p53是一個發現較早的抑癌基因，其表達水平降低與包括食管癌在內的多種腫瘤的發生密切相關[23,24]。食管癌細胞中過表達p53可引起癌細胞的凋亡[25]。本研究結果顯示，沉默Eca109細胞STC-1的表達后Ki67、p-JAK2和p-STAT3的表達均顯著降低，p53的表達升高。這提示STC-1可通過下調JAK2/STAT3信號通路影響食管鱗癌的增殖和凋亡。腫瘤的微環境是一個復雜的小生態環境，從細胞惡性轉變到腫瘤的血管生成、侵襲轉移、免疫逃逸等一系列過程均能影響腫瘤的發生發展。炎性細胞因子IL-1β和TNF-α作為腫瘤微環境的構成成分既可以由腫瘤細胞自身分子，也可由免疫細胞分泌至腫瘤微環境中，從而作用于腫瘤細胞[26]。有研究發現，降低腫瘤IL-1β和TNF-α的表達可通過破壞腫瘤微環境影響腫瘤發生發展[27]。本研究結果顯示，沉默Eca109細胞STC-1的表達后IL-1β和TNF-α的表達明顯降低。這提示Eca109對食管癌細胞生長抑制作用可能與下調IL-1β和TNF-α的表達有關。

綜上所述，STC-1在食管鱗癌細胞中高表達，抑制其表達后癌細胞活力顯著降低，凋亡率升高，此作用可能與抑制JAK2/STAT3信號通路及炎癥因子如IL-1β和TNF-α的表達有關。STC-1對食管鱗癌其他生物學特性及機制有待進一步研究。但本研究為STC-1在食管鱗癌中的作用研究奠定了一定的基礎。