整合PD-L1單鏈抗體的融合蛋白制備及其抗腫瘤活性的驗證①

談 燚 秦中強 周萬飛 李紅俊 劉明珠 許文青 李正紅 李永海

(蚌埠醫學院病理生理學實驗室，蚌埠 233030)

關于癌癥的免疫治療策略，已經從全身的、非特異性的模擬免疫系統發展到靶向性的活化免疫系統的某種特定部分。這種靶向性的治療最終結果會降低免疫治療的毒性并增加其療效[1]。免疫檢查點治療，靶向作用于T細胞中的調節途徑以增強抗腫瘤免疫應答，已取得重要的臨床進展，并為癌癥治療提供了新的武器。這種治療已經表現出持久的臨床作用，并且在一小部分患者中，患者多年沒有出現癌癥的臨床癥狀，得到長期緩解[2]。免疫治療已經改變了一些類型腫瘤的治療策略，如黑素瘤，以及最近的非小細胞肺癌。惡性腫瘤的免疫逃逸是腫瘤形成和進展所必需的，是癌癥的重要標志。因此，近年來，增強免疫系統的療法在治療惡性腫瘤方面取得了顯著的成功，尤其突出的是對免疫檢查點封鎖的治療方法，其是針對T細胞抑制受體或免疫檢查點的治療[3]。免疫檢查點對于維持自我耐受性至關重要，并且已知一些腫瘤利用免疫檢查點系統來逃避抗腫瘤免疫反應，例如針對程序性細胞死亡因子-1(PD-1/PD-L1)途徑的免疫檢查點封鎖治療晚期NSCLC，已經作為單一療法或聯合治療，取得顯著的臨床益處[4]。

程序性死亡因子1(PD-1)及其配體(PD-L1)是一對免疫負性共刺激因子。PD-1及其配體PD-L1通路的活化在T細胞的免疫耐受并形成免疫抑制微環境中起到重要作用[5，6]。PD-1/PD-L1信號通路的激活，可以導致體內T細胞“耗竭”，抑制性腫瘤微環境形成，使腫瘤細胞逃脫免疫監視和殺傷；而阻斷此信號通路，則可以逆轉其腫瘤微環境，增強內源性抗腫瘤效應。靶向免疫檢查點調節劑如程序性細胞死亡1(PD-1)/PD-1配體1(PD-L1)已經在各種癌癥中取得了顯著的益處，導致多種臨床針對其他相關B7/CD28家族成員的抗體試驗[7，8]。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 pFuse真核表達載體由本實驗室保存；A549(肺腺癌細胞)購自合肥中科院；293F(人胚腎細胞)由本實驗室保存；包含識別人PD-L1蛋白的單鏈抗體的核苷酸序列由上海生工合成；PCR引物序列一對：正向引物：5′-TCTTGCACTGTCACGAATTCGGAAGTGCAGCTGCTGGAA-TC-3′，反向引物：5′-GCGGCCGCAAGGTACCACAGCACGGTCACTTTGGTG-3′，由上海生工合成。Trans5a感受態：購自全式金；限制性內切酶： DPNⅠ內切酶 KpnI-HF、EcoRI-HF，DNA 連接酶：Assembly Master Mix，購自NEB公司；DNA Marker購自TaKaRa公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒；TIANGEN無內毒素大提試劑盒；高糖DMEM購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；聚乙烯亞胺(PEI)轉染試劑MW-25000購自美國Polyscienca公司；Pro 293a-CDM購自美國Lonza公司；HiTrap Protein G HP購自GE Health-care；Alexa Fluor594購自Jackson Immuno-Research； Human PD-L1購自Sino Biological Inc；人外周血淋巴細胞分離液購自TBD Science；RP1640培養液購自美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒購自Biosharp；熒光染料Alexa Fluor 594購自Jackson公司。

裸鼠，8只，均為雌鼠，體重22 g左右，購自蚌埠醫學院實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，合格證編號：No.201709312]。

小動物成像儀(德國Bruker，In-Vivo MS FX PRO)；倒置顯微鏡(日本Olympus，CKX41型)；高速離心機(美國Beckman)；快速液相蛋白分離純化系統(美國GE，AKTA Explorer 100)。

1.2方法

1.2.1表達scFv-mFc融合蛋白的真核表達重組載體構建 以識別人PD-L1蛋白的單鏈抗體的核苷酸序列(由生工公司合成)為模板，PCR擴增獲得大量目的基因片段，基因經KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切，經Assembly Master Mix連接酶連接到同樣被雙酶切的pFuse真核表達載體上，轉化到Trans5a感受態細胞，從過夜培養的細菌培養板上挑取單克隆進行酶切驗證和DNA測序驗證。

1.2.2scFv-mFc融合蛋白的表達與純化 用大提試劑盒提取重組載體，濃度約1 μg/μl，并采用脂質體轉染法(質?！肞EI約為2∶3)轉染到293F細胞。收集無血清培養液中分泌的融合蛋白并使用快速蛋白液相分離純化系統將其進行純化。

1.2.3免疫組化 將荷瘤小鼠瘤體剝離，制成石蠟切塊，制片。免疫組化檢測制備的融合蛋白的活性。適當稀釋的融合蛋白(1 μg/μl，稀釋比例1∶200)，用購買的兔抗人PD-L1單克隆抗體作為陽性對照(稀釋1∶200)。

1.2.4scFv-mFc融合蛋白的細胞結合實驗(流式細胞術) 用DMSO將購買的Alexa Fluor594溶解為1.5 μg/μl，將A549細胞用胰酶消化，離心重懸后，細胞計數，使每個EP管中細胞數在1.0×105個。設置空白組(不加融合蛋白，只加Alexa Fluor594)，陰性對照組(加融合蛋白+PD-L1蛋白+Alexa Fluor594)，梯度實驗組(加融合蛋白+Alexa Fluor594，設置融合蛋白梯度，分別為1 μg、5 μg)。上流式細胞儀檢測細胞結合的陽性率。

1.2.5ADCC實驗 培養靶細胞A549，用人外周血淋巴細胞分離液將抽取的外周靜脈血分離，得實驗需要的淋巴細胞。在試劑盒的96孔板中進行細胞殺傷實驗。設置空白組：靶細胞+分離的淋巴細胞。實驗組：靶細胞+淋巴細胞+融合蛋白(觀察與蛋白劑量有無關系，設置加入不同的蛋白量作為對比，組內分別加入蛋白1、3、10 μg)，每組設置復孔。放在細胞培養箱內4～6 h，酶標儀分別測每個孔0.5、1、2、4 h在450 nm處的吸光值，并繪制趨勢圖。

1.2.6scFv-mFc融合蛋白對荷瘤小鼠腫瘤生長的作用 在裸鼠后肢處接種A549細胞，數量為1.0×106個。20 d后開始記錄裸鼠腫瘤體積(長徑×短徑2/2)，每2 d測量1次，記錄8次之后，每只裸鼠腹腔每次注射100 μg的融合蛋白，按上述方法繼續記錄8次，計算未注射融合蛋白和注射融合蛋白之后的體積平均增長率。

1.2.7熒光標記融合蛋白注射荷瘤小鼠結果 荷瘤鼠腹腔注射熒光染料標記的融合蛋白，將溶于DMSO的熒光染料加入融合蛋白中，根據實驗中心小動物成像儀和熒光染料的性質，選用激發光波長720 nm，發射光波長790 nm。通過腹腔注射，每只荷瘤鼠注射約100 μg熒光標記的融合蛋白，觀察不同時間，融合蛋白在體內的分布代謝情況。觀察時間分別為注射前，注射后30 min，2、4、12、24 h。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0進行數據處理。兩獨立樣本之間采取t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1表達scFv-mFc融合蛋白的真核表達載體構建(圖1A)，重組質粒送公司測序，目標scFv-mFc基因片段長718 bp，與設計的目標基因片段相符(圖1B)。

2.2表達與純化的scFv-mFc融合蛋白(圖2),經免疫組化和流式細胞術結果示，融合蛋白與表面高表達PD-L1蛋白的腫瘤細胞有較強的結合能力(圖3、4)；ADCC實驗結果示融合蛋白在體外對腫瘤細胞的殺傷作用(圖5)；荷瘤小鼠實驗結果示融合蛋白對腫瘤的生長起到抑制作用，在5 mg/kg的藥物劑量下，荷瘤小鼠瘤體體積平均增長率從14.90%降低至3.72%，兩獨立樣本t檢驗P<0.05，差異具有統計學意義(圖6)。通過熒光標記融合蛋白腹腔注射至荷瘤鼠體內，小動物成像儀觀察發現融合蛋白在體內分布呈一定的趨向性(圖7)。

圖1 表達scFv-mFc融合蛋白的真核表達重組質粒構建Fig.1 Construct eukaryotic expression recombinant plas-mid which express scFv-mFc fusion proteinNote: A.Construct the eukaryotic expression recombinant plasmid；IL2SP:Signal peptide sequence of human interleukin 2；mFc：Fc segment of mouse IgG2a；B.The result of agarose gel exposure after PCR amplification of scFv gene sequence；C.The recombinant plasmid was digested by restriction endonuclease，and exposured with scFv(1.scFv；2.Recombinant plasmid；M.Marker).

圖2 scFv-mFc融合蛋白的表達與純化Fig.2 Expression and purification of scFv-mFc fus-ion proteinNote: A.Western blot results of serum-free medium collected after transfection the recombinant plasmid；B.Purify the fusion protein by the rapid liquid protein separation and purification system(AKTA)，and the second peak was collected.

圖4 scFv-mFc融合蛋白流式結果分析Fig.4 Results of flow analysis of scFv-mFc fusion proteinNote: A.The binding rate of A549 cells in the experimental group was higher than that in the blank group，and the binding rate increased with the increase in the amount of fusion protein(Ab)；B.An experimental group with a certain amount of fusion protein(Ab，5 μg/ml)added，the binding rate of cell A549 was higher than that of the negative control group(added the same amount of fusion protein and a certain amount of PD-L1 protein).The above image shows that the fusion protein scFV-mFc binds specifically to the PD-L1 protein on the surface of A549 cells.

圖5 ADCC實驗結果Fig.5 ADCC resultsNote: Compared with the blank group(with lymphocytes only)，the cell survival rate of the experimental group(plus lymphocytes and fusion protein)was lower.In the experimental group，the cell survival rate was correspondingly decreased with the increase in the amount of fusion protein.

圖6 scFv-mFc融合蛋白對荷瘤鼠腫瘤生長的抑瘤率Fig.6 Tumor inhibition rate of fusion protein of scFv-mFc on transplanted tumor of tumor-bearing miceNote: The volume growth rate of each tumor-bearing mice before and after the fusion protein injection was calculated，the results showed that the average tumor volume growth rate of tumor-bearing mice decreased from 14.90% to 3.72% after injecting the fusion protein.The two independent samples was tested byt-test，P<0.05，the difference was statistically significant.This shows that the fusion protein has an inhibitory effect on the tumor in vivo.

圖7 熒光標記融合蛋白注射荷瘤鼠結果Fig.7 Fluorescent-tagged fusion protein injected into tumor bearing miceNote: The fusion protein labeled with red fluorescence was intraperitoneally injected and showed a certain tendency in tumor-bearing mice.As time progressed，it accumulated on the tumor and the tumor turned from the initial low signal to a red high fluorescence signal，demonstrate that the labeled fusion protein can still specifically recognize the PD-L1 protein on the tumor cell surface.

3 討論

癌癥是人類尚未攻克的醫學難題，目前常規的治療手段為手術治療、化學藥物治療、放射治療等，由于腫瘤本身易擴散、轉移等生物學特性，這些傳統的治療手段收到的效果都不甚理想。近年來，使用免疫檢查點抑制劑來治療惡性腫瘤的報道越來越多，如針對免疫檢查點分子PD-L1的單克隆抗體最近應用在治療轉移性黑色素瘤、轉移性腎癌、晚期/難治性非小細胞肺癌、結直腸癌[9-12]，有文獻報道稱PD-L1的單克隆抗體Atezolizumab在晚期非小細胞肺癌的療效確切、不良反應發生率低[13]。除上述腫瘤外，前列腺癌、乳腺癌、膠質瘤等惡性腫瘤中PD-L1均有較高的表達[14-16]，這也為免疫治療提供了理論可能。

從腫瘤免疫的提出，到將腫瘤免疫應用于臨床治療，經歷了近百年的歷史，自從2011年始，多種免疫檢查點阻斷劑和靶向性免疫細胞藥物在多種惡性腫瘤的臨床治療中取得了較好的效果，極大推動了免疫治療從臨床前研究到臨床應用的進展[17]。2013年，在Science評選的年度十大科技突破中，腫瘤的免疫治療居首位[18]。

目前研究存在的問題是部分患者因個體差異無應答，出現轉移灶或免疫應答下降，腫瘤復發，存在細胞毒性等。在如何選擇合適生物標志物，篩選獲益人群，尋找新靶點來開發單一治療藥物及聯合治療方案的選擇方面仍需不斷深入研究。當前關于腫瘤免疫治療研究的新進展也值得我們關注，比如利用納米載藥系統的生物降解佳、靶向性好、制劑形式多樣化開發的聚合物納米粒、樹枝狀聚合物等提高腫瘤免疫治療的效率[19]。精準醫療和個體化醫療的發展結合患者情況采用制定最有效治療方案，推動腫瘤免疫療法不斷進步，提高了該療法的可行性。

隨著研究的不斷進展，腫瘤免疫治療必將走向規范化和標準化。目前腫瘤的免疫治療策略主要集中在阻斷T細胞的檢查點上，并取得了一定的效果。這些藥物僅對特定的腫瘤有較好效果，但有明顯的副作用。上文提到的免疫檢查點，PD-1/PD-L1通路，僅是癌癥免疫逃逸的機制之一。這要求我們更加深入的研究癌癥免疫逃逸的機制和腫瘤微環境形成的因素，開發出更加有效的免疫治療藥物。腫瘤細胞可以通過多種途徑逃避或反擊機體免疫系統，各個機制之間相互影響，密切聯系，現在對免疫與腫瘤關系研究不斷深入，但仍未將免疫與腫瘤之間相互攻擊與防御所涉及的細胞與分子構成的網絡研究清楚。

本實驗目的是為了檢測融合蛋白的抗腫瘤活性，以期為腫瘤的臨床免疫治療提供基礎實驗支持。實驗結果證明在肺腺癌細胞A549上有PD-L1蛋白的表達，融合蛋白能與PD-L1蛋白特異性結合，并對肺腺癌細胞產生殺傷作用，而裸鼠體內實驗證明了融合蛋白的抑制腫瘤生長的作用。以上結果為PD-L1抗體在肺腺癌臨床免疫治療中提供了實驗室依據。