ε-聚賴氨酸對牡蠣的防腐抗菌效果

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(1.山東省農業科學院農產品研究所,山東省農產品精深加工技術重點實驗室, 農業農村部新食品資源加工重點實驗室,山東濟南 250100; 2.奧本大學生物系統工程學院,美國阿拉巴馬州 36849; 3.北京工商大學,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京 100048)

牡蠣含有豐富的營養物質,有“海洋牛奶”之稱,是一種藥食同源的海洋生物,具有較高的營養價值和一定的藥理作用[1]。開殼牡蠣因缺少保護組織而容易遭受微生物的侵染,直接影響新鮮牡蠣的銷售,還會對鮮牡蠣的食用安全造成隱患。同時,隨著人們對食品安全的重視,天然、綠色的生物防腐劑受到越來越多的青睞。茶多酚、山梨酸鉀、普魯蘭多糖以及乳酸球菌復合型天然防腐保鮮劑在牡蠣的冷儲保藏研究中均表現出較好效果,可顯著延長貨架期,表明生物防腐保鮮劑用于牡蠣保鮮是切實有效的[2-3],這對于延長去殼牡蠣保鮮期,促進養殖牡蠣的發展有一定作用。

ε-聚賴氨酸水溶性好,具有較高的安全性,能夠在人體內分解為賴氨酸,其抑菌范圍廣,能夠抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒等多種微生物[4-5],用于米飯、軟飲料、沙拉、奶酪、魚[6-7]和即食烤牛肉[8]等的防腐保鮮,效果顯著。因此,本研究以ε-聚賴氨酸為研究對象,以開殼牡蠣的各項參數為評價指標,考查其對牡蠣貯藏過程中的防腐抗菌效果。有研究使用0.1%、1%和2%濃度的ε-聚賴氨酸作用于即食烤牛肉,結果顯示其能有效控制7 d內牛肉中病原菌的數量[8],為探究ε-聚賴氨酸抗牡蠣微生物增殖的有效濃度范圍,參考上述實驗結果,并考慮病原菌和研究對象的差異性,本實驗初步確定較為寬泛的ε-聚賴氨酸試驗濃度為0.2%、2%,以期為后續深入研究提供有效數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣(Crassostreavirginica) Bon Secour Fisheries公司提供,采集于阿拉巴馬州墨西哥灣,去殼后加冰運送,次日抵達實驗室,直接送入4 ℃冷藏庫;ε-聚賴氨酸(3500～4500 Da) Carbosynth公司,用無菌水配制成0.2%和2%的質量濃度,用于保鮮實驗;鄰苯二甲醛溶液(o-phthalaldehyde,OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯溶液(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC)、硼酸鹽緩沖溶液 Agilent試劑公司;氨基酸標準溶液 Sigma試劑公司;其他化學試劑 均為分析純。

Whirl-PakTM過濾袋(254×300 mm) NascoTM公司;BagMixer 400W拍打式均質器 Interscience公司;BUCHI Mixer B-400均質儀 BUCHI公司;TA-XT2i質構儀 Stable Microsystems公司;Vibra cellTM裂解儀 Sonics公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣保鮮預處理 開殼牡蠣用超純水沖洗除去表面黏液和附著物,瀝干水分后,選取大小均一的個體隨機分組,單個牡蠣重量為13～15 g,使用濃度為0.2%和2%的無菌ε-聚賴氨酸溶液浸潤處理(每10顆牡蠣浸于200 mL溶液),以無菌水處理過的牡蠣為空白組,瀝干后置于自封袋中,每組8個牡蠣,在(4±1) ℃條件下進行試驗,在0、5、10、13、16 和19 d取樣檢測。

1.2.2 細菌總數測定 取一整顆牡蠣置于無菌過濾袋中,加入90 mL無菌水,用拍打式均質器均質10 min,從無菌袋另一側取濾液作為供試樣品,參照國家標準GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行牡蠣中菌落總數的測定。

1.2.3 pH測定 稱取5 g勻漿的牡蠣肉糜,加入50 mL的去離子水,裂解儀超聲震蕩30 s,離心后使用pH計測定上清液pH。

1.2.4 揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)測定 稱取10 g勻漿的牡蠣肉糜,加入4%的三氯乙酸溶液(Trichloroacetic acid,TCA)40 mL,裂解儀超聲震蕩30 s,室溫27 ℃靜置30 min,4500 r/min、25 ℃離心15 min,取上清液作為供試樣品[9],參照國家標準GB 5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》進行TVB-N的測定,以4%的TCA作為對照,實驗結果取3次測量的平均值。

1.2.5 質構TPA的測定 采用TA-XT2i質構儀TA30探頭,使用5 kg的力量感應元校準,取一整顆牡蠣置于探頭正下方,參考文獻[9]所述設置操作參數。基本參數如下:測試加速度為 2 mm/s,壓縮形變量設為50%,完成兩個按壓動作,兩次按壓時間間隔為5 s。試驗數據由計算機自動讀取,每組設置6個平行。

1.2.6 游離氨基酸(Free amino acids,FAA)的測定 稱取0.2 g勻漿的牡蠣肉糜,加入1 mL的10% TCA,超聲震蕩30 s后,室溫27 ℃靜置15 min,15000 r/min、25 ℃離心15 min,上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試樣品。樣品經程序進樣處理(Agilent application note 5990-5599EN),吸取1 μL供試樣品、2.5 μL硼酸鹽緩沖液、0.5 μL OPA溶液、0.4 μL FMOC溶液、32 μL蒸餾水置于定量環中混合,進樣20 μL進行分析。

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流動相A:10 mmol/L磷酸氫二鈉-四硼酸鈉(pH8.2);流動相B:乙腈-甲醇-雙蒸水(體積比45∶45∶10);梯度洗脫:0～1 min,2% B;1～35 min,2%～57% B;35～55 min,57%～100% B;55～65 min,100% B。流速:1 mL/min;DAD檢測波長:338、262 nm(用于蛋白質的檢出)。

1.3 數據處理

數據使用Excel 2010軟件進行統計分析;方差分析結果均以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示;使用SPSS 22.0軟件Duncan法進行顯著性分析,P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著;以氨基酸的摩爾濃度(μmol/mL)為橫坐標,不同濃度氨基酸峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,根據測定的樣品峰面積計算FAA的含量。

2 結果與分析

2.1 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣菌落總數的影響

由圖1可以看出,牡蠣貯藏0 d,初始菌落數在4.85lg CFU/g左右,在貯藏5 d時,空白組菌落數已經達到6.14lg CFU/g(增加了1.29lg CFU/g),低濃度處理組(0.2%)為5.03lg CFU/g,而高濃度處理組(2%)僅為4.61lg CFU/g,與空白組相比,試驗組菌落數至少低1個數量級,抑制效果顯著(P<0.05);2%ε-聚賴氨酸處理組效果較空白組差異極顯著(P<0.01);此外,2%ε-聚賴氨酸不僅抑制微生物生長,還有殺菌作用,該組較貯藏0 d菌落數降低了0.24lg CFU/g,減小了4.95%。低濃度ε-聚賴氨酸通過破壞微生物細胞膜導致細胞內代謝失衡來實現抑菌效果;而高濃度的ε-聚賴氨酸導致細胞膜的滲透性明顯增加,在細胞膜上形成膠束,磷脂雙分子層彎曲并穿孔,最后導致細胞死亡[10-12]。隨著貯藏時間的延長,貯藏10 d抑制作用逐漸減弱,與空白組相比,0.2% ε-聚賴氨酸抑菌效果并不顯著(P>0.05),菌落數與空白組相近;但2% ε-聚賴氨酸的抑菌效果仍優于另外兩組,差異顯著(P<0.05)。在第10 d,菌落總數雖然并未達到7lg CFU/g的腐敗臨界值[13],但空白組牡蠣明顯變黏,有異味,已發生輕微腐敗,因此將取樣間隔調整為3 d。第13 d,高濃度ε-聚賴氨酸處理組菌落數較空白組仍有顯著差異(P<0.05),直至第16 d與空白組趨于一致。

圖1 牡蠣貯藏過程中菌落總數變化Fig.1 Changes of the total bacterial count of oysters during the storage注:*:P<0.05,相同貯藏時間與空白組差異顯著; **:P<0.01,在相同貯藏時間 與空白組差異極顯著;圖2～圖5同。

2.2 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣pH的影響

測得牡蠣初始pH為6.61±0.01,與文獻[9]測得值相近。研究表明,牡蠣肉在貯藏過程中,會發生pH先降低后升高的現象[14-15],是由于牡蠣肉中含有較多的糖原,糖原發生分解生成乳酸,以及ATP酶降解釋放出無機磷[14],使得牡蠣肉的pH下降,此后牡蠣肉中的蛋白質逐漸分解,產生氨以及胺類等堿性含氮物質,造成pH逐漸升高。圖2中,三組牡蠣在貯藏期間pH沒有明顯上升,貯藏5 d的牡蠣肉的pH沒有明顯改變(P>0.05),表明此時還未發生糖原的大量分解;但是10 d的pH有不同程度的降低,pH劇烈下降,與兩個ε-聚賴氨酸處理組相比,空白組pH降低顯著(P<0.05),而高濃度處理組對pH的影響與空白組相比差異極顯著(P<0.01),變化趨勢與菌落數一致。空白組和低濃度處理組發生pH持續降低,可能是因為微生物降解蛋白質的程度要弱于乳糖的降解速率。高濃度處理組牡蠣在貯藏后期(16～19 d)pH稍有上升,表明該組牡蠣蛋白質分解速度加快,釋放堿性含氮物質的量增加。

圖2 牡蠣貯藏過程中pH變化Fig.2 Changes of pH of oysters during the storage

2.3 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間TVB-N的影響

牡蠣在貯藏過程中由于微生物和酶的作用發生自溶,蛋白質逐漸分解產生胺類等堿性含氮物質,隨著牡蠣體內的微生物大量繁殖,生成氨、甲胺和三甲胺等揮發性鹽基氮(TVB-N),積累到一定程度時,表明牡蠣進入腐敗期,不能食用[14]。圖3中貯藏初期0～5 d,空白組和低濃度處理組TVB-N值呈緩慢上升趨勢,無顯著差異(P>0.05),而高濃度處理組與空白組相比差異極顯著(P<0.01);隨后在5～10 d,空白組和低濃度處理組的TVB-N值迅速增加,增加了6.79～7.04 mg/100 g,而高濃度處理組僅增加了1.34 mg/100 g,表明高濃度ε-聚賴氨酸能抑制微生物分解蛋白質。推測在貯藏初期,微生物數量少,分解蛋白質的速度慢,隨著微生物的大量增殖,降解速率也隨之迅速提升。空白組牡蠣在第10 d已經出現輕微腐敗現象,而TVB-N值大約在(22.95±0.90) mg/100 g,遠低于海產魚在腐敗初期的TVBN值(30 mg/100 g)[16],而本研究實驗發現,TVB-N值為20 mg/100 g時,牡蠣已到達腐敗初期[2,17],有的研究中TVB-N值僅為10 mg/100 g,牡蠣中菌落數卻已經超標,牡蠣也已發生腐敗[9,18]。結果表明TVB-N值與牡蠣的腐敗程度是相關的,TVB-N值越高,腐敗程度越嚴重;但針對不同品種[18],甚至同一海域的同品種牡蠣[9],不同處理方式,甚至可能源于不同的季節,造成可接受的劣變TVB-N值界限有很大差異,并不能單純設定一個TVB-N值用于評定牡蠣的新鮮度。

表1 空白組牡蠣質構TPA的變化情況Table 1 Texture profile analysis(TPA)of the control oysters

注:*:P<0.05,相同指標與貯藏0 d牡蠣差異顯著;表2同。

圖3 牡蠣貯藏過程中TVB-N值變化Fig.3 Changes of total volatile basic nitrogen of the oysters during the storage

2.4 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣TPA質構的影響

通過表1中空白組牡蠣質構結果發現,在貯藏期間,牡蠣即使發生輕微腐敗變質,彈性、內聚性和粘附性等參數均沒有顯著差異(P>0.05),因此,不作為評測牡蠣品質的直接指標。此外,咀嚼性是由硬度、內聚性、彈性共同決定的,有研究發現硬度與咀嚼性呈極顯著正相關[19-21],本實驗結果也表明,硬度與咀嚼性的變化趨勢一致。因此,本研究選擇差異性顯著的參數(硬度和回復性)作為考察指標,用以評價ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間質構TPA的影響。

由圖4A可知,空白組牡蠣在貯藏初期的0～10 d,硬度快速減小,在10～16 d開始放緩,推測微生物代謝活躍和酶的作用使牡蠣發生自溶,蛋白質逐漸分解導致肉質結構松散,硬度變差[22]。而ε-聚賴氨酸處理過的牡蠣在0～5 d硬度變化趨勢與空白組相近,結合高濃度ε-聚賴氨酸組的牡蠣菌落總數、pH和TVB-N值均得到有效控制可知,蛋白質分解程度應優于空白組,但0～5 d各組牡蠣減小趨勢一致,表明此時牡蠣硬度的變化與蛋白質的分解無明顯相關性,可能是影響牡蠣硬度的其他因素發生變化,如水分、脂肪、鹽含量、淀粉含量等[19];貯藏5～10 d，ε-聚賴氨酸處理組的牡蠣硬度減小趨勢放緩,優于空白組,但差異并不顯著(P>0.05),2%ε-聚賴氨酸處理的牡蠣在10～13 d,硬度增加極顯著(P<0.01),表明2%ε-聚賴氨酸對于控制微生物增殖代謝,維持牡蠣硬度有顯著效果。

回復性是測量樣品從第一次變形中回復的能力[23],牡蠣貯藏過程中回復性變化如圖4B所示,空白組牡蠣在0～5 d,回復性迅速下降,此后發生波動下降,可能源于牡蠣自溶致組織軟爛,而導致回復性降低;2% ε-聚賴氨酸處理的牡蠣在0～5 d下降趨勢減緩,在第10 d差異顯著(P<0.05),此后,其回復性變化趨勢與空白組一致,差異不顯著(P>0.05)。TPA質構結果表明,ε-聚賴氨酸可通過抑制微生物的增殖,延緩牡蠣自溶的程度進而提高牡蠣貯藏品質。

圖4 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間質構TPA的影響Fig.4 Effects of ε-polylysine treatment on texture profile analysis(TPA)of oysters during the storage注:A:牡蠣貯藏期間硬度的變化; B:牡蠣貯藏期間回復性的變化。

2.5 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間FAA的影響

FAA是水產品風味品質和評價鮮度的一個重要指標,在貯藏0 d,對未處理牡蠣中的FAA進行測定,檢測出表2中所示的9種游離氨基酸,以丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)的含量最豐富,Ala和Gly為呈甜味氨基酸,Glu為呈鮮味氨基酸[24-26],三者占檢出游離氨基酸總量的85.35%。與貯藏0 d相比,Glu含量先升高后降低,差異顯著(P<0.05);而Gly含量在5 d顯著(P<0.05)降低后,不再升高;Ala則與之相反,在貯藏初期0～16 d,含量無顯著變化,反而在16～19 d顯著(P<0.05)升高。

表2 未經處理的牡蠣中游離氨基酸的含量Table 2 Free amino acids contents of untreated oysters

注:*:0 d牡蠣中所檢測出的游離氨基酸占總游離氨基酸的比例;(+):味道愉悅;(-):味道不佳;-:未有文獻報道;ND:未檢測出。

圖5 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間FAA的影響Fig.5 Effects of ε-polylysine treatment on free amino acids of the oysters during the storage注:A:甘氨酸含量變化;B:谷氨酸含量變化;C:丙氨酸含量變化;D:游離氨基酸含量變化。

不同實驗組的差異如圖5A～圖5C所示,在貯藏初期0～5 d,三種主要呈味氨基酸的含量都有不同程度的降低,Gly和Glu下降明顯,表明牡蠣的風味品質在變差,而Ala含量在貯藏后期有了大幅提高,變化趨勢與陳桂平[27]測定的草魚冷凍期間氨基酸含量一致。在貯藏的0～10 d,三組牡蠣的三種氨基酸含量沒有顯著差異(P>0.05),說明ε-聚賴氨酸對牡蠣風味的保持沒有作用;而在貯藏后期,在酶和微生物作用下,蛋白質和氨基酸逐漸被分解,使得牡蠣發生腐敗變質[28],10 d后的氨基酸變化趨勢表明,2%ε-聚賴氨酸處理的牡蠣中,Glu和Gly含量較空白組和低濃度處理組變化平緩,其中,在貯藏16～19 d,Glu含量差異顯著(P<0.05),而Ala在16～19 d也表現出了顯著差異(P<0.05),表明2% ε-聚賴氨酸能有效控制微生物增殖和代謝活性。FAA總含量的變化趨勢更能體現出高濃度ε-聚賴氨酸對微生物代謝活性有抑制作用(圖5D),在貯藏后期13 d,隨著蛋白質逐漸分解,空白組游離氨基酸含量逐漸升高,高濃度處理組和低濃度處理組游離氨基酸總量要低于空白組,且差異顯著(P<0.05);貯藏的第19 d,空白組游離氨基酸總量達到60.52 mg/g,0.2%和2%ε-聚賴氨酸處理組僅為46.17和43.24 mg/g,差異極顯著(P<0.01),可見ε-聚賴氨酸能抑制微生物對蛋白質的降解作用,或可間接證明ε-聚賴氨酸通過抑制微生物增殖從而減緩蛋白質的降解過程。

3 結論

兩種濃度ε-聚賴氨酸(2%和0.2%)對牡蠣均有防腐效果。未經處理的牡蠣空白組,在貯藏第5 d,菌落數即增加了1.29lg CFU/g,由于牡蠣自溶和蛋白質分解,在貯藏的5～10 d開始,各項參數(pH、TVB-N值、TPA質構、FAA含量)發生明顯變化;0.2%ε-聚賴氨酸在保藏初期對牡蠣中微生物增殖有抑制作用,菌落數沒有明顯增加,在5～10 d效果開始減弱,菌落數迅速增加;2%ε-聚賴氨酸在貯藏初期有殺菌作用,第5 d菌落數甚至減小了4.95%,同時延緩pH和TVB-N的變化程度,在貯藏的10～13 d發生顯著(P<0.05)變化。貯藏19 d,高濃度組牡蠣中游離氨基酸增加小于空白組,推測ε-聚賴氨酸可通過緩解牡蠣蛋白質的水解過程,改善牡蠣貯藏時間和產品的品質。結果表明,ε-聚賴氨酸主要通過抑制微生物的生長增殖,并抑制微生物對牡蠣的分解來延長牡蠣的保藏時間。

復合保鮮劑(殼聚糖、茶多酚、溶菌酶)處理牡蠣,能將牡蠣的貨架期延長近1倍[2],而徐莉等[3]則采用響應面法對茶多酚、山梨酸、普魯蘭多糖進行復配組合,證實復合保鮮劑的保鮮效果要顯著優于單一組分的保鮮劑。本研究證實ε-聚賴氨酸能抑制牡蠣微生物增殖,延緩牡蠣腐敗進程,在后續研究中,或可考慮將其與其他保鮮劑復配,制備天然、高效防腐保鮮劑,這對于延長牡蠣保鮮期,應對鮮牡蠣食用安全隱患可提供有效策略。